Name: calcium chloride dna uptake in e. coli
Uploaded: 2023-04-30T07:10:31.000Z
Duration: 10 min 54 s
Channel: JoVE

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Florida Department of Education

High School

Life Science

SC.912.L.16

SC.912.L.16.7

transformation-e-coli-cells-using-an-adapted-calcium-chloride

Transformation of E. coli Cells Using an Adapted Calcium Chloride Procedure

Este protocolo describe la preparación y transformación de E. coli DH5 competente utilizando una adaptación del procedimiento de cloruro de calcio (12).
1. Configuración
<ol><li>
Equipo
	<ul>
<li>Espectrofotómetro</li>
		<li>Centrífuga Sorval (o equivalente)</li>
		<li>Centrífuga de sobremesa</li>
		<li>Bloque de calor o baño de agua</li>
		<li>Agitador orbital</li>
		<li>Incubadora estacionaria</li>
		<li>Bandeja de fundición de gel</li>
		<li>Bueno peines</li>
		<li>Fuente de tensión</li>
		<li>Caja de gel</li>
		<li>Fuente de luz UV</li>
		<li>Microondas</li>
	</ul>
</li>
	<li>
Soluciones y reactivos
	<ul>
<li>Caldo Luria-Bertani (LB) (10 g de hidrolizado enzimático de caseína, extracto de levadura de 5 g y 5 g de cloruro sódico en 1000 ml de H2O)</li>
		<li>Caldo super óptimo con represión catabolita (SOC): (2% (p.v) triptona, 0,5% (p/v) extracto de levadura, 10 mM de NaCl, 2,5 mM de KCl, 10 mM MgCl2,10 mM MgSO4y 20 mM de glucosa)</li>
		<li>CaCl2-MgCl2 (80 mM MgCl2, 20 mM CaCl2) solución.</li>
		<li>M CaCl2 solución (si las células se transformarán inmediatamente) o 0.1M CaCl2 solución que contiene 10% (v/ v) glicerol (si las células se congelarán para uso futuro).</li>
		<li>Placas de agar LB</li>
		<li>Placas selectivas de agar LB (para este experimento, ya que el plásmido utilizado confiere resistencia a la ampicilina, se utilizaron placas de agar LB que contienen ampicilina 100 g/ml)</li>
		<li>
Cepa de E. coli DH5</li>
		<li>ADN plásmido pUC19 (100 pg/l)</li>
		<li>Kit de miniprep de giro QIAprep (Qiagen)</li>
		<li>
Hind III enzima de restricción</li>
		<li>1 kb más escalera de ADN</li>
		<li>Bajo punto de fusión Agarose</li>
		<li>1X tacolcha TAE (base Tris de 40 mM, ácido acético de 20 mM y EDTA de 1 mM)</li>
		<li>Bromuro de etidio (10mg/ml)</li>
	</ul>
</li>
	<li>
Notas generales de seguridad E. coli DH5 está clasificado como Nivel de Bioseguridad 1 (BSL1). Los microbios de esta categoría representan poca o ninguna amenaza de infección en adultos sanos. Sin embargo, se requiere una manipulación cuidadosa del microorganismo.</li>
</ol>IMPORTANTE todos los pasos de este protocolo deben llevarse a cabo utilizando técnicas asépticas y sobre temperaturas de hielo o de 4oC a menos que se indique.
2. Protocolo
<ol><li>A partir de un stock congelado de E. coli DH5 (congelado en 20% glicerol de un cultivo nocturno cultivado en LB) raya las bacterias para el aislamiento en una placa de agar LB. Incubar a 37oC durante la noche (16-20 horas).</li>
	<li>Inocular una sola colonia en 3 ml de caldo LB en un tubo. Crecer agitando a 210 rpm a 37oC durante la noche (16-20 horas).</li>
	<li>Mida el OD600 de la cultura nocturna. Utilice el cultivo nocturno para inocular 100 ml de caldo LB en un matraz de 1 litro a un OD600-0.01. Incubar el cultivo agitando vigorosamente (210 rpm) a 37oC monitoreando OD600 en el espectrofotómetro cada 15-20 min, hasta que el cultivo alcance OD600-0,35 (aproximadamente 3 horas). NOTA: Para que la transformación sea eficiente, las células bacterianas deben estar en la fase de crecimiento exponencial medio. El número máximo de células debe ser de 108 células/ml, que para la mayoría de las cepas de E. coli corresponde a OD600-0.4. El uso del espectrofotómetro permite medir el OD600, lo que permite determinar que las células se encuentran en la etapa de crecimiento adecuada. Si este protocolo se utilizará para otras cepas de bacterias, la calibración para determinar el número de colonias que forman unidades en valores OD600 específicos será necesaria para determinar esta correlación.</li>
	<li>Transfiera los 50 ml del cultivo a cada una de las 2 botellas de centrífuga de polipropileno helada. Coloque las botellas sobre hielo durante 20 minutos para enfriarlas.</li>
	<li>Recuperar las células por centrifugación a 2700g (4100 rpm en un rotor Sorval GSA) durante 10 min a 4oC.</li>
	<li>Retire el sobrenadante. Escurra los últimos rastros de medios colocando la botella boca abajo sobre una almohadilla o una toalla de papel.</li>
	<li>Resuspenda cada pellet bacteriano en 30 ml de una solución helada CaCl2-MgCl2 (80 mM MgCl2, 20 mM CaCl2). Primero agregue 5 ml de la solución, gire cuidadosamente hasta que el pellet se haya disuelto por completo y luego agregue los 25 ml restantes de solución.</li>
	<li>Repita el paso 2.4.</li>
	<li>Repita el paso 2.5.</li>
	<li>Si las células competentes van a ser transformadas directamente, resuspende cada pellet bacteriano en 2 ml de una solución helada CaCl2 (0.1 M) girando los tubos cuidadosamente. Si el pellet no se resuspende con este método, resuspende pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo (evitando la formación de burbujas). Alternativamente, las células competentes se pueden congelar y almacenar para su uso posterior. Para preparar las existencias congeladas de células competentes, resuspenda el pellet en 2 ml de una solución caCl2 de 0,1M que contenga 10% (v/v) de glicerol. Esta solución debe estar helada. Suspensión de células alícuotas en tubos de polipropileno de 1,5 ml de hielo (160 ml por tubo). Congele las células competentes inmediatamente en un baño de hielo seco/etanol. Transfiera los tubos a un congelador de -70oC.</li>
	<li>Para transformar las células tratadas con CaCl2,transfiera 50 ml de células competentes a cada uno de los 2 tubos de polipropileno de 1,5 ml. Añadir los 1 l (100 pg) de ADN plásmido pUC19 a uno de los tubos y dejar el segundo tubo sin ADN (control negativo). Mezclar suavemente (evitar la formación de burbujas). Incubar durante 30 minutos sobre hielo. NOTA: No se deben utilizar más de 50 ng de ADN en un volumen de 10 ml o menos en la transformación.</li>
	<li>Transfiera los tubos al bloque de calor e incubar a 42oC durante 45 s exactamente. NOTA: El choque por calor es un paso crítico. No exceda la temperatura ni el tiempo de incubación.</li>
	<li>Transfiera fácilmente los tubos al hielo. Incubar durante 2 min.</li>
	<li>Añadir 950 l de medios SOC e incubar los tubos durante 1 hora a 37 oC para permitir que las bacterias se recuperen y expresen el marcador resistente a los antibióticos codificado en el plásmido.</li>
	<li>Diluir 10 ml de la suspensión celular en 1000 ml en SOC (1/100 de dilución) y 100 l de la suspensión celular en 1000 ml en SOC (1/10 de dilución). Placa 100 l de las diluciones, así como el control, en placas selectivas, y se extiende nifique utilizando una espátula. Por lo general, el chapado de 100 ml de una dilución de 1/100 y 1/10 producirá un número suficiente de unidades formadoras de colonias (cfu) por placa. Idealmente, este número debe oscilar entre 30-300 cfu para que haya suficientes colonias pero separadas entre sí. Sin embargo, el número de cfu dependerá de la eficiencia de la transformación (consulte la Sección análisis de datos y resultados).</li>
	<li>Incubar las placas a 37oC. Las colonias transformadas deben aparecer en 12-16 horas (este rango dependerá de la cepa celular y el método de selección). Ninguna colonia debe crecer en el control negativo.</li>
	<li>Contar el cfu/placa obtenido para la transformación (Tabla 1).</li>
	<li>Para verificar que los transformadores albergan el plásmido pUC19, se realizará una preparación plásmido y posterior digestión. Para ello, inocular una sola colonia en 3 ml de caldo LB en un tubo. Crecer agitando a 210 rpm a 37oC durante la noche (16-20 horas).</li>
	<li>Prepare una preparación de plásmido utilizando el kit miniprep QIAprep Spin, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.</li>
	<li>Digerir el 1 g de pUC19 purificado con la enzima de restricción HindIII a 37oC durante 1 hora. NOTA: Cualquier enzima que corte en el sitio de clonación múltiple pUC19 se puede utilizar para este paso.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Componente</td>
			<td>Cantidad</td>
		</tr>
<tr>
<td>10X Búfer de resumen de restricción</td>
			<td>2,5 l</td>
		</tr>
<tr>
<td>Plásmido pUC19</td>
			<td>1 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Hind Ⅲ</td>
			<td>1 l</td>
		</tr>
<tr>
<td>H2O</td>
			<td>20,5 l (a 25 l)</td>
		</tr>
</tbody></table><ol start="21"><li>Ejecuta una escalera de peso molecular, ADN pUC19 digerido y la misma cantidad de ADN pUC19 no digerido en un gel de agarosa del 1% que contiene bromuro de etidio de 1 g/ml durante 1 hora a 95 V. NOTA: el tiempo y el voltaje variarán dependiendo del equipo utilizado.</li>
	<li>Visualice el gel bajo luz UV. Compare el tamaño del ADN pUC19 digerido y no digerido(Figura 2) (consulte la Sección Análisis de datos y resultados). Continúe con los pasos necesarios necesarios para verificar la transformación de acuerdo con el objetivo de cada experimento de transformación en particular.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10515/10515fig2.jpg"> Figura 2: Digestión del ADN plásmido recuperado de células transformadas DH5. El ADN del plásmido se recuperó de las células transformadas de DH5, digerido con HindIII, ejecutado en un gel de agarosa del 1% y visualizado con una fuente UV (pasos 2.19 a 2.22).
3. Análisis de datos y resultados
Para calcular la eficiencia de la transformación, es necesario contar un indicador de lo bien que las células tomaron el ADN extracelular, las colonias obtenidas en la transformación:
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Dilución</td>
			<td>Ufc</td>
		</tr>
<tr>
<td>1/100</td>
			<td>34</td>
		</tr>
<tr>
<td>1/10</td>
			<td>246</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: Unidades formadoras de colonias (cfu) contadas a partir del experimento de transformación.
La eficiencia de transformación (TE) es una medida del número de cfu resultante de la transformación de 1 g de plásmido en un volumen determinado de células competentes. Muchos parámetros afectan a la eficiencia de la transformación: tamaño plásmido, genotipo celular, etapa de crecimiento durante la preparación de la competencia, métodos de transformación, etc.). Al calcular el TE es importante considerar qué dilución (si la hay) se realizó antes del enchapado e incorporarla en el cálculo del número total de cfu. La eficiencia de transformación (TE) se calcula con la siguiente ecuación:
<img src="/files/ftp_upload/10515/10515eq1.jpg">
En primer lugar, divida el cfu por el g de ADN, en este ejemplo 0.0001 g. A continuación, divida el resultado por el factor de dilución. En este ejemplo, se utilizó una dilución de 1/10 y se celenó 100 ml de una solución de 1 ml (dilución: 1/10 a 100 l /1000 l a 0,01).
<img src="/files/ftp_upload/10515/10515eq2.jpg">

La transformación es un método potente para introducir ADN exógeno en células bacterianas que es clave para muchas aplicaciones de biología molecular en el laboratorio. Además, desempeña un papel importante en la naturaleza al permitir que las células bacterianas intercambien material genético que podría resultar en una mayor variación genética y permitir la adquisición de diferentes rasgos beneficiosos para la supervivencia bajo una amplia gama de condiciones. Muchas cepas bacterianas codifican los genes necesarios para...

transformación de células e. coli mediante un procedimiento con cloruro de calcio

Fuente: Natalia Martin1, Andrew J. Van Alst1, Rhiannon M. LeVeque1, y Victor J. DiRita1 1 Departamento de Microbiología y Genética Molecular de la Universidad Estatal de Michigan
Las bacterias tienen la capacidad de intercambiar material genético (ácido desoxirribonucleico, ADN) en un proceso conocido como transferencia de genes horizontal. La incorporación de ADN exógeno proporciona un mecanismo mediante el cual las bacterias pueden adquirir nuevos rasgos genéticos que les permiten adaptarse a las condiciones ambientales cambiantes, como la presencia de antibióticos o anticuerpos (1) o moléculas que se encuentran en hábitats naturales (2). Existen tres mecanismos de transferencia génica horizontal: transformación, transducción y conjugación (3). Aquí nos centraremos en la transformación, la capacidad de las bacterias para tomar ADN libre del medio ambiente. En el laboratorio, el proceso de transformación consta de cuatro pasos generales: 1) Preparación de células competentes, 2) Incubación de células competentes con ADN, 3) Recuperación de células y 4) Placado de las células para el crecimiento de los transformadores (Figura 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10515/10515fig1.jpg"> Figura 1: Pasos generales del proceso de transformación. El proceso de transformación tiene cuatro pasos generales: 1) Preparación de células competentes, 2) Incubación con ADN, 3) Recuperación de las células y 4) Células de chapado para el crecimiento de los transformadores.
Para que se produzca la transformación, las bacterias receptoras deben estar en un estado conocido como competencia. Algunas bacterias tienen la capacidad de llegar a ser naturalmente competentes en respuesta a ciertas condiciones ambientales. Sin embargo, muchas otras bacterias no se vuelven competentes naturalmente, o las condiciones para este proceso son aún desconocidas. La capacidad de introducir ADN en bacterias tiene una gama de aplicaciones de investigación: generar múltiples copias de una molécula de ADN de interés, para expresar una gran cantidad de proteínas, como un componente en los procedimientos de clonación, y otros. Debido al valor de la transformación a la biología molecular, existen varios protocolos destinados a hacer que las células sean artificialmente competentes cuando se desconocen las condiciones de competencia natural. Se utilizan dos métodos principales para preparar células artificialmente competentes: 1) a través del tratamiento químico de las células y 2) la exposición de las células a pulsos eléctricos (electroporación). El primero utiliza diferentes productos químicos dependiendo del procedimiento para crear atracción entre el ADN y la superficie celular, mientras que el segundo utiliza campos eléctricos para generar poros en la membrana celular bacteriana a través de la cual pueden entrar las moléculas de ADN. El enfoque más eficiente para la competencia química es la incubación con cationes divalentes, sobre todo calcio (Ca2+) (4,5) Competencia inducida por calcio es el procedimiento que se describirá aquí (6). Este método se utiliza principalmente para la transformación de bacterias Gram-negativas, y ese será el foco de este protocolo.
El procedimiento de transformación química implica una serie de pasos en los que las células están expuestas a cationes para inducir la competencia química. Estos pasos son seguidos posteriormente por un cambio de temperatura - choque de calor - que favorece la absorción de ADN extraño por la célula competente (7). Los sobres de las células bacterianas se cargan negativamente. En bacterias Gram-negativas como Escherichia coli, la membrana externa se carga negativamente debido a la presencia de lipopolisacárido (LPS) (8). Esto resulta en la repulsión de las moléculas de ADN cargadas negativamente de manera similar. En la inducción de competencia química, los iones de calcio cargados positivamente neutralizan esta repulsión de carga permitiendo la absorción del ADN en la superficie celular (9). El tratamiento del calcio y la incubación con ADN se realizan sobre hielo. Posteriormente, se realiza una incubación a temperaturas más altas (42oC), el choque de calor. Este desequilibrio de temperatura favorece aún más la aceptación del ADN. Las células bacterianas deben estar en la fase de crecimiento exponencial medio para soportar el tratamiento de choque térmico; en otras etapas de crecimiento las células bacterianas son demasiado sensibles al calor, lo que resulta en una pérdida de viabilidad que disminuye significativamente la eficiencia de transformación.
Diferentes fuentes de ADN se pueden utilizar para la transformación. Típicamente, plásmidos, pequeñas moléculas circulares de ADN de doble cadena, se utilizan para la transformación en la mayoría de los procedimientos de laboratorio en E. coli. Para que los plásmidos se mantengan en la célula bacteriana después de la transformación, deben contener un origen de replicación. Esto permite que se repliquen en la célula bacteriana independientemente del cromosoma bacteriano. No todas las células bacterianas se transforman durante el procedimiento de transformación. Por lo tanto, la transformación produce una mezcla de células transformadas y células no transformadas. Para distinguir entre estas dos poblaciones, se utiliza un método de selección para identificar las celdas que han adquirido el plásmido. Los plásmidos suelen contener marcadores seleccionables, que son genes que codifican un rasgo que confiere una ventaja para el crecimiento (es decir, resistencia a un antibiótico o químico o rescate de una auxotrofia de crecimiento). Después de la transformación, las células bacterianas se chapan en medios selectivos, lo que sólo permite el crecimiento de las células transformadas. En el caso de las células transformadas con un plásmido que confiere resistencia a un antibiótico dado, los medios selectivos serán medios de crecimiento que contengan ese antibiótico. Se pueden utilizar varios métodos diferentes para confirmar que las colonias cultivadas en los medios selectivos son transformadores (es decir, han incorporado el plásmido). Por ejemplo, los plásmidos pueden recuperarse de estas células utilizando métodos de preparación de plásmidos (10) y digeridos para confirmar el tamaño del plásmido. Alternativamente, la PCR de colonia se puede utilizar para confirmar la presencia del plásmido de interés (11).
El objetivo de este experimento es preparar las células químicamente competentes de E. coli DH5, utilizando una adaptación del procedimiento de cloruro de calcio (12), y transformarlas con el plásmido pUC19 para determinar la eficiencia de transformación. La cepa de E. coli DH5 es una cepa comúnmente utilizada en aplicaciones de biología molecular. Debido a su genotipo, específicamente el recA1 y endA1, esta cepa permite una mayor estabilidad de la plaquita y mejorar la calidad del ADN plásmido en preparaciones posteriores. Dado que la eficiencia de transformación disminuye con el aumento del tamaño del ADN, el plásmido pUC19 se utilizó en este protocolo debido a su pequeño tamaño (2686 bp) (ver https://www.mobitec.com/cms/products/bio/04_vector_sys/standard_cloning_vectors.html para un vectores). pUC19 confiere resistencia a la ampicilina y, por lo tanto, este fue el antibiótico utilizado para la selección.

Aunque TE depende de muchos factores, las preparaciones celulares competentes no comerciales, como esta, normalmente producen de 106 a 107 transformadores por microgramo de plásmido. Por lo tanto, esta preparación, con un TE de 2,46 x 108 cfu/g, produjo un TE mucho más allá del rango esperado. Existen protocolos adicionales para fabricar celdas supercompetentes cuando se requieren mayores eficiencias de transformación para una aplicación determinada (<stro...

Transformación de células E. coli mediante un procedimiento con cloruro de calcio

Source: Natalia Martin1, Andrew J. Van Alst1, Rhiannon M. LeVeque1, and Victor J. DiRita1
1 Department of Microbiology and Molecular Genetics, Michigan ...

Las bacterias son notablemente adaptables y un mecanismo que facilita esta adaptación es su capacidad para absorber moléculas externas de ADN. Un tipo de ADN que las bacterias pueden absorber se llama plásmido, una pieza circular de ADN que con frecuencia contiene información útil, como genes de resistencia a los antibióticos. El proceso de modificación de las bacterias mediante nueva información genética incorporada de una fuente externa se denomina transformación. La transformación se puede realizar fácilmente en el laboratorio utilizando Escherichia coli o E. coli. Para ser transformadas, las células de E. coli primero deben ser competentes, lo que significa que deben ser capaces de absorber moléculas de ADN de su entorno. El protocolo para lograr esto es sorprendentemente simple, una breve incubación de las células en una solución de cloruro de calcio. Esta incubación hace que las células se vuelvan permeables a las moléculas de ADN. Después de que las células se granulan por centrifugación, se elimina el sobrenadante. El ADN plasmídico se añade ahora a las células competentes. Después de incubar las células con ADN, la mezcla se calienta brevemente a 42 grados centígrados, seguido de un enfriamiento rápido en hielo. Este choque térmico hace que el ADN se transfiera a través de la pared y las membranas de la célula. A continuación, las células se incuban en medios frescos. Luego, las bacterias se colocan a 37 grados para permitirles volver a sellar sus membranas y expresar proteínas resistentes. Las células que han absorbido los plásmidos copiarán fielmente el ADN y lo transmitirán a su progenie y expresarán cualquier proteína que pueda ser codificada por él, incluidos los mediadores de resistencia a los antibióticos. Esos genes de resistencia se pueden utilizar como marcadores seleccionables para identificar bacterias que se han transformado con éxito porque las células que no han absorbido el plásmido no expresarán el producto del gen de resistencia. Esto significa que cuando las células se colocan en un medio sólido que contiene el antibiótico adecuado, solo crecerán las células que hayan absorbido el plásmido. La transformación de las células en una colonia en crecimiento se puede confirmar aún más cultivando esas células en medios líquidos durante la noche para aumentar el rendimiento antes de extraer el ADN de la muestra. Una vez que se aísla el ADN, se puede llevar a cabo una digestión diagnóstica de la enzima de restricción. Debido a que las enzimas de restricción cortan el ADN en ubicaciones predecibles, la ejecución de estos digestores en un gel debería mostrar un patrón predecible si el plásmido deseado se transformó con éxito. Por ejemplo, si se prepara pUC19 y se corta con la enzima de restricción HindIII, se debe ver una sola banda de 2686 nucleótidos en el gel. En este laboratorio, transformará la cepa de E. coli DH-5 Alpha con pUC19 y luego confirmará la transformación exitosa mediante electroforesis en gel de ADN. Antes de comenzar el procedimiento, póngase el equipo de protección personal adecuado, que incluye una bata de laboratorio y guantes. A continuación, esterilice el espacio de trabajo con etanol al 70%. Ahora, prepare células químicamente competentes depositando un bucle lleno de bacterias en una placa de agar LB estéril y rayando las bacterias con un nuevo bucle. Luego, incube la placa a 37 grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, vuelva a esterilizar la mesa de trabajo con etanol al 70% y retire la placa de la incubadora. Inocular una sola colonia bien aislada en 3 mililitros de caldo LB en un tubo con un asa estéril. Luego, cultive el cultivo a 37 grados centígrados durante la noche, agitando a 210 RPM. Al día siguiente, mida la densidad óptica del cultivo nocturno con un espectrofotómetro. A continuación, se añaden 100 mililitros de caldo LB a un matraz de un litro y se inocula con el cultivo durante la noche a una densidad óptica de 0. 01. Ahora, incube el cultivo a 37 grados centígrados con agitación y verifique el OD600 cada 15 a 20 minutos hasta que el cultivo alcance la fase de crecimiento exponencial medio. Después de aproximadamente tres horas, transfiera 50 mililitros del cultivo a dos botellas de polipropileno heladas. Luego, vuelva a colocar las botellas en hielo durante 20 minutos para que se enfríen. A continuación, recupere las células mediante centrifugación. Deseche los sobrenadantes y coloque los biberones boca abajo sobre una toalla de papel. A continuación, vuelva a suspender el pellet bacteriano en cinco mililitros de solución helada de cloruro de calcio y cloruro de magnesio y revuelva con cuidado hasta que el pellet se haya disuelto por completo. Luego, agregue otros 25 mililitros de la solución a la pastilla bacteriana disuelta. Vuelva a suspender el otro gránulo bacteriano como se demostró anteriormente. Después de esto, repita la centrifugación y retire los sobrenadantes. Si las células competentes se van a transformar directamente, vuelva a suspender cada gránulo bacteriano en dos mililitros de una solución helada de cloruro de calcio 0,1 molar agitando los tubos con cuidado. Para comenzar el procedimiento de transformación, transfiera 50 microlitros de células competentes a dos tubos de polipropileno de 1,5 mililitros marcados. A continuación, añada un microlitro de ADN plasmídico pUC19 a uno de los tubos. Mezclar suavemente, evitando la formación de burbujas, e incubar ambos tubos durante 30 minutos en hielo. Después de la incubación, transfiera los tubos a un bloque de calor e incube a 42 grados centígrados durante 45 segundos. Transfiera inmediatamente los tubos a hielo e incube durante dos minutos. Ahora, agregue 950 microlitros de medio SOC a cada tubo e incube durante una hora a 37 grados Celsius para permitir que las bacterias se recuperen y expresen el marcador de resistencia a los antibióticos codificado en el plásmido. Para hacer una dilución de 1 a 100, agregue 990 microlitros de medio SOC y 10 microlitros de suspensión celular a un tubo de 1,5 mililitros. A continuación, haga una dilución de 1 a 10 añadiendo 900 microlitros de medio SOC y 100 microlitros de suspensión celular a un tubo de 1,5 mililitros. A continuación, coloque 100 microlitros de las suspensiones celulares diluidas y 100 microlitros del control negativo, en placas selectivas separadas que contengan ampicilina utilizando un esparcidor e incube las placas a 37 grados centígrados durante 12 a 16 horas. Después de la incubación, cuente las unidades formadoras de colonias, o UFC, por placa, obtenidas a través de la transformación, y registre estos datos. Para verificar que los transformantes tienen el plásmido pUC19, se escoge una sola colonia bien aislada de una placa con un asa estéril e introdúcela en un tubo que contenga 3 mililitros de caldo LB. Luego, incubar el cultivo a 37 grados centígrados con agitación, durante la noche. Al día siguiente, use un mini kit de preparación de ADN para aislar el ADN de 3 mililitros del cultivo, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de completar la mini preparación de ADN, digiera 1 microgramo de pUC19 purificado con una enzima de restricción a 37 grados centígrados durante 1 hora. Ahora, cargue 20 microlitros de una escala de peso molecular, 1 microgramo de ADN plasmídico digerido y 1 microgramo de ADN plásmido no digerido en pocillos consecutivos de un gel de agarosa al 1% que contiene 1 microgramo por mililitro de bromuro de etidio. Luego, haga funcionar el gel durante 1 hora a 95 voltios. Por último, visualiza el gel con un iluminador UV. En este experimento, se prepararon células químicamente competentes de E. coli DH5 Alpha utilizando una adaptación del procedimiento de cloruro de calcio, y luego se transformaron con el plásmido pUC19 para determinar la eficiencia de la transformación. Para calcular la eficiencia de la transformación, utilice los recuentos de UFC registrados para las diluciones de 1 en 100 y 1 en 10, y cualquier otra dilución con recuentos de UFC entre 30 y 300. Primero, el recuento de UFC registrado, 246 en este ejemplo, se divide por la cantidad de ADN, 0,0001 microgramos aquí, que se plateó. Luego, este número se divide por el factor de dilución utilizado para dar la eficiencia de transformación en UFC por microgramo. En este ejemplo, se utilizó una dilución de 1 a 10 y se colocaron 100 microlitros de una solución de 1 mililitro, lo que dio un factor de dilución final de 0,01. En el carril de plásmidos no digerido, el ADN circular puede aparecer como dos o tres bandas diferentes de brillo variable. Esto se debe a que el ADN circular sin cortar puede existir en varios estados de conformación diferentes, como superenrollado, círculo abierto o más lineal, y cada uno de ellos se mueve a través del gel a diferentes velocidades. El análisis de la digestión del ADN plasmídico recuperado indicó que el plásmido utilizado tiene un tamaño esperado de ADN pUC19, 2.686 pares de bases.

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calcium chloride dna uptake in e. coli

Calcium chloride treatment can help E. coli take up foreign DNA. This chemical transformation method is used in molecular biology to move a plasmid into bacterial cells and then identify the cells that received it. The protocol described here uses chemically competent E. coli DH5α cells and the plasmid pUC19 to measure transformation efficiency.

Bacteria can exchange genetic material through horizontal gene transfer. The three main routes are transformation, transduction, and conjugation. Transformation is the process in which bacteria take up free DNA from the environment. In the lab, it usually includes four steps: preparing competent cells, mixing cells with DNA, recovering the cells, and plating them so transformants can grow.

For transformation to occur, cells must be competent, which means they can take in DNA. Some bacteria become naturally competent under certain conditions. Others do not, or the conditions are not known. For that reason, scientists often make cells artificially competent. Two common approaches are chemical treatment and electroporation, which uses electric pulses to open pores in the cell membrane.

This protocol uses calcium ions, especially Ca2+, to create chemical competence. It is mainly used with Gram-negative bacteria. E. coli cells and their outer membrane carry negative charge, and DNA is also negatively charged. Calcium helps neutralize this repulsion so DNA can attach to the cell surface. The cells and DNA are kept on ice during this step, and then a heat shock at 42°C helps drive DNA into the cells.

The cells must be in mid-exponential growth phase before heat shock. At other growth stages, they are more sensitive to heat and may lose viability. That lowers transformation efficiency. The DNA used for transformation is usually a plasmid, which is a small circular double-stranded DNA molecule. To stay in the cell after transformation, the plasmid must have an origin of replication so it can copy itself independently of the bacterial chromosome.

Not every cell becomes transformed, so the result is a mix of transformed and non-transformed cells. To find the cells that received the plasmid, the procedure uses selection. Plasmids often carry selectable markers, such as antibiotic resistance genes or genes that rescue a growth need. After transformation, the cells are plated on selective media. In this case, the media contains ampicillin, which allows only the transformed cells to grow.

Calcium Chloride DNA Uptake in E. coli

creating a winogradsky column: a method to enrich the microbial species in a sediment sample

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Winogradsky Column Microbial Layers and Gradients

A Winogradsky column shows how microbial layers form in mud and water over time. It is a clear, enclosed ecosystem that helps scientists grow sediment microbes that are hard to culture in a test tube or on a petri dish. By keeping conditions close to a microbe’s natural habitat, the column makes it possible to study organisms that help drive Earth’s biogeochemical cycles. The column is built from pond or wetland sediment mixed with water in a transparent container. Extra sources of carbon,...

serial dilutions and plating: microbial enumeration

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Counting Bacteria with Dilution Plates

Counting bacteria with dilution plates helps microbiologists estimate how many cells are in a sample. Because bacteria can grow quickly and may be hard to count directly, serial dilution and plating make the concentration easier to measure. These methods have been used for more than a century to study bacterial and viral loads in clinical, industrial, pharmaceutical, and academic labs. Serial dilution reduces a sample in steps. A small volume of the original solution is moved into a fixed...

enrichment cultures: culturing aerobic and anaerobic microbes on selective and differential medias

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Selective Media for Bacterial Isolation

Selective media help scientists isolate bacteria by supporting some microbes and blocking others. This lab also uses differential media, which reveal a visible chemical trait in the organism being grown. Together, these methods help identify bacteria from mixed samples. Prokaryotic cells live in almost every environment on Earth. They also show wide metabolic diversity, so the growth medium must supply the molecules they need for energy. Some microbes are extremophiles, meaning they live in...

pure cultures and streak plating: isolation of single bacterial colonies from a mixed sample

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Streak Plate Method for Isolating Bacteria

The streak plate method is used to isolate single bacterial colonies from a mixed sample. It helps separate one bacterial type from another so a pure culture can be grown. This is important in both clinical and research settings, where bacteria often grow together in mixed cultures. Pure cultures are needed for later genetic and protein studies. They are also used to check whether a sample is pure and to identify infectious agents from clinical samples. Because different strains can affect...

16s rrna sequencing: a pcr-based technique to identify bacterial species

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Bacterial ID with 16S rRNA Gene Sequencing

Bacterial identification with 16S rRNA gene sequencing helps scientists tell bacterial species apart. It is used in microbial ecology to study biodiversity in environmental samples and in medical microbiology to help diagnose infected patients. Traditional methods include microscopy, growth on specific media, biochemical and serological tests, and antibiotic sensitivity assays. Molecular methods have changed how bacteria are identified. 16S ribosomal RNA (rRNA) gene sequencing is often faster...

growth curves: generating growth curves using colony forming units and optical density measurements

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Bacterial Growth Stages and Cell Counts

Bacterial growth stages and cell counts show how a culture changes over time. This page follows a batch culture as it moves through lag, exponential, stationary, and death phases. It also shows how colony forming units, or CFU, and optical density can be used to measure that growth. Lag phase is the time bacteria need to adjust to a new environment before fast division begins. During exponential phase, cells grow and divide at the fastest rate, and DNA replication, RNA transcription, and...

antibiotic susceptibility testing: epsilometer tests to determine mic values of two antibiotics and evaluate antibiotic synergy

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Measuring Bacterial Resistance with E-Tests

Measuring bacterial resistance with E-tests helps show how strongly an antibiotic can stop growth. The method is used to find the minimal inhibitory concentration, or MIC, which is the lowest antibiotic level that prevents visible bacterial growth. It is a practical way to study resistance in bacteria and compare how different antibiotics perform. The E-test uses a plastic strip that contains a built-in antibiotic gradient. The strip is placed on an agar plate that has been inoculated with...

microscopy and staining: gram, capsule, and endospore staining

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Bacterial Stains for Cell Walls and Spores

Bacterial stains help scientists see cell walls, capsules, and endospores with a compound light microscope. Many bacteria are hard to tell apart with light alone because they are small, colorless, and can look similar under the lens. Staining makes these hidden features visible and helps identify different bacteria. A compound microscope uses more than one lens to magnify a sample. Its objective lens collects light near the specimen, and the eyepiece enlarges the image. Many compound...

plaque assay: a method to determine viral titer as plaque forming units (pfu)

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Phage Plaque Test for Counting Viruses

Bacteriophages, or phages, are viruses that infect prokaryotic cells. The plaque assay is a classic way to count these viruses by measuring viral titer, which is the amount of virus in a sample. It was first described in 1952 and is still one of the most reliable methods for determining viral titer. Phages were identified in the early 20th century by Twort and d'Hérelle. They have since been recognized for their therapeutic value and for their role in human and global ecosystems. Interest in...

transformation of e. coli cells using an adapted calcium chloride procedure

Calcium chloride treatment can help E. coli take up foreign DNA. This chemical transformation method is used in molecular biology to move a plasmid into bacterial cells and then identify the cells that received it. The protocol described here uses chemically competent E. coli DH5α cells and the plasmid pUC19 to measure transformation efficiency. Bacteria can exchange genetic material through horizontal gene transfer. The three main routes are transformation, transduction, and conjugation.

conjugation: a method to transfer ampicillin resistance from donor to recipient e. coli

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Bacterial Gene Transfer by Conjugation in E. coli

Bacterial conjugation is a form of horizontal gene transfer in E. coli that moves DNA from one cell to another through direct contact. It was first discovered by Lederberg and Tatum in 1946. Unlike transformation or transduction, conjugation is a natural, one-way transfer of DNA from a donor cell to a recipient cell. This process can increase bacterial genetic diversity. It is often described as a type of bacterial mating. It has also helped drive the spread of antibiotic-resistant bacteria.

phage transduction: a method to transfer ampicillin resistance from donor to recipient e. coli

phage-transduction-method-to-transfer-ampicillin-resistance-from

Using P1 Phage to Move Antibiotic Resistance in E. coli

Bacteriophage transduction moves DNA between bacteria by using a phage, or bacterial virus, as the carrier. In this process, a phage can deliver genetic material from one bacterium to another. The method is a form of horizontal gene transfer and is important in both bacterial evolution and laboratory genetics. Phages were first described in the early 1900s, and transduction was named in 1951 by Norton Zinder and Joshua Lederberg. The transcript describes two main phage classes. Lytic phages...

microbiology

Esta colección brinda las herramientas clave en la investigación microbiológica, incluyendo la técnica estéril adecuada y el revestimiento, cómo utilizar medios selectivos y enriquecer muestras, y métodos de cultivo para muestras mixtas o puras. Además, proporciona información sobre como examinar los métodos comunes para identificar aislados microbianos, así como procedimientos para la manipulación genética de bacterias.

See how calcium chloride makes E. coli competent for DNA uptake, then use heat shock and ampicillin selection to identify transformants.

Calcium Chloride DNA Uptake in E. coli | JoVE K12

Natalia Martin

Andrew J. Van Alst

Rhiannon M. LeVeque

Victor J. DiRita

Department of Microbiology and Molecular Genetics

Michigan State University

Concepts

Performing the Experiment

Results

Genetic Lingo

Overview

An organism is diploid if it inherits two variants, or alleles, of each gene, one from each parent. These two alleles constitute the genotype ...

Punnett Squares

Overview

A Punnett square displays the possible genotypes offspring can inherit from two parental genotypes. If a trait&#x2019;s inheritance pattern ...

Monohybrid Crosses

Overview

In the 1850s and 1860s, Gregor Mendel investigated inheritance by performing monohybrid crosses in pea plants. He crossed two plants that were ...

Dihybrid Crosses

Overview

To determine whether traits are inherited together or separately, Gregor Mendel crossed pea plants that differed in two traits. These parental ...

Law of Segregation

When crossing pea plants, Mendel noticed that one of the parental traits would sometimes disappear in the first generation of offspring, called the F1 ...

Law of Independent Assortment

While Mendel&#x2019;s Law of Segregation states that the two alleles for one gene are separated into different gametes, a different question of how ...

Test Cross

Alleles are different forms of the same gene. Humans and other diploid organisms inherit two alleles of every gene, one from each parent.

An allele is ...

Pedigree Analysis

Overview

A pedigree is a diagram displaying a family&#x2019;s history of a trait. Analyzing pedigrees can reveal (1) whether a trait is dominant or ...

Use Mendel's laws of segregation and independent assortment to analyze patterns of inheritance.

SC.912.L.16.1

Trihybrid Crosses

Trihybrid Crosses
Some of Mendel&#8217;s crosses examined three pairs of contrasting characteristics. Such a cross is called a trihybrid cross. A ...

Chi-square Analysis

The chi-square test is a statistical hypothesis test. It is used to check whether there is a significant difference between an expected value and an ...

Multiple Allele Traits

Incomplete Dominance

Gregor Mendel&#39;s work (1822 - 1884) was primarily focused on pea plants. Through his initial experiments, he determined that every gene in a diploid ...

Lethal Alleles

Agouti: A Lethal Allele
Lucien Cu&#233;not discovered lethal alleles in 1905 while studying the inheritance of coat color in mice. The agouti gene is ...

Polygenic Traits

background-and-environment-affect-phenotype

Background and Environment Affect Phenotype

Although the genetic makeup of an organism plays a major role in determining the phenotype, there are also several environmental factors, such as ...

Discuss observed inheritance patterns caused by various modes of inheritance, including dominant, recessive, codominant, sex-linked, polygenic, and multiple alleles.

SC.912.L.16.2

Base-pairing and DNA Repair

The DNA Replication Fork

Lagging Strand Synthesis

The Replisome

Proofreading

Synthesis of new DNA molecules is carried out by the enzyme DNA polymerase, which adds nucleotides on the daughter strand complementary to the template ...

Replication in Prokaryotes

DNA replication has three main steps: initiation, elongation, and termination. Replication in prokaryotes begins when initiator proteins bind to the ...

Replication in Eukaryotes

In eukaryotic cells, DNA replication is highly conserved and tightly regulated. Multiple linear chromosomes must be duplicated with high fidelity before ...

Describe the basic process of DNA replication and how it relates to the transmission and conservation of the genetic information.

SC.912.L.16.3

The DNA Helix

Deoxyribonucleic acid, or DNA, is the genetic material responsible for passing traits from generation to generation in all organisms and most viruses. DNA ...

Mutations

Mutations are changes in the sequence of DNA. These changes can occur spontaneously or they can be induced by exposure to environmental factors. Mutations ...

Mutation, Gene Flow, and Genetic Drift

In a population that is not at Hardy-Weinberg equilibrium, the frequency of alleles changes over time. Therefore, any deviations from the five conditions ...

Explain how mutations in the DNA sequence may or may not result in phenotypic change. Explain how mutations in gametes may result in phenotypic changes in offspring.

SC.912.L.16.4

What is Gene Expression?

A gene is a stretch of DNA that serves as the blueprint for functional RNAs and proteins. Since DNA is comprised&#160; of nucleotides and proteins are ...

RNA Structure

The basic structure of RNA consists of a string of ribonucleotides attached by phosphodiester bonds. Although most RNA is single-stranded, it can form ...

Types of RNA

Three main types of RNA are involved in protein synthesis: messenger RNA (mRNA), transfer RNA (tRNA), and ribosomal RNA (rRNA). These RNAs perform diverse ...

Transcription

Transcription is the synthesis of RNA from a DNA sequence by RNA polymerase. It is the first step in producing a protein from a gene sequence. ...

Bacterial RNA Polymerase

Eukaryotic RNA Polymerases

General Transcription Factors

Tissue-specific transcription factors contribute to diverse cellular functions in mammals. For example, the gene for beta globin, a major component of ...

RNA Polymerase II Accessory Proteins

Transcription Elongation Factors

pre-mrna-processing-modification-of-pre-mrna-ends

Pre-mRNA Processing: Modification of pre-mRNA Ends

In eukaryotic cells, transcripts made by RNA polymerase are modified and processed before exiting the nucleus. Unprocessed RNA is called precursor mRNA or ...

Pre-mRNA Processing: RNA Splicing

Transfer RNA Synthesis

Ribosomal RNA Synthesis

The Nucleolus

Additional Subnuclear Structures

Translation

Translation is the process of synthesizing proteins from the genetic information carried by messenger RNA (mRNA). Following transcription, it constitutes ...

Ribosomes

Ribosomes translate genetic information encoded by messenger RNA (mRNA) into proteins. Both prokaryotic and eukaryotic cells have ribosomes. Cells that ...

tRNA Activation

Initiation of Translation

Termination of Translation

Improving Translational Accuracy

Nonsense-mediated mRNA Decay

Molecular Chaperones and Protein Folding

The Proteasome

Regulated Protein Degradation

Proteins: From Genes to Degradation

Explain the basic processes of transcription and translation, and how they result in the expression of genes.

SC.912.L.16.5

Chromatin Structure and RNA Splicing

Alternative RNA Splicing

Nuclear Export of mRNA

Discuss the mechanisms for regulation of gene expression in prokaryotes and eukaryotes at transcription and translation level.

SC.912.L.16.6

Molecular Cloning

Molecular cloning is a set of methods, which are used to insert recombinant DNA into a vector - a carrier of DNA molecules that will replicate recombinant ...

An Overview of Genetic Engineering

Genetic engineering &#8211; the process of purposefully altering an organism&#8217;s DNA &#8211; has been used to create powerful research tools and model ...

Recombineering and Gene Targeting

One of the most widely used tools in modern biology is molecular cloning with restriction enzymes, which create compatible ends between DNA fragments that ...

bacterial-transformation-the-heat-shock-method

Bacterial Transformation: The Heat Shock Method

Transformation is the process that occurs when a cell ingests foreign DNA from its surroundings. Transformation can occur in nature in certain types of ...

Bacterial Transformation: Electroporation

The term &#x201C;transformation&#x201D; refers cellular ingestion of foreign DNA.  In nature, transformation can occur in certain types of bacteria.  In ...

An Introduction to Transfection

Transfection is the process of inserting genetic material, such as DNA and double stranded RNA, into mammalian cells. The insertion of DNA into a cell ...

Conjugation: A Method to Transfer Ampicillin Resistance from Donor to Recipient E. coli

Source: Alexander S. Gold1, Tonya M. Colpitts1
1 Department of Microbiology, Boston University School of Medicine, National Emerging Infections Diseases ...

Phage Transduction: A Method to Transfer Ampicillin Resistance from Donor to Recipient E. coli

CRISPR

Bacterial Transformation

Background

In early 20th century, pneumonia was accountable for a large portion of infectious disease deaths1. In order to develop an effective vaccine ...

Bacterial Transformation
ExpandFirst, ensure that each student or student group has a filled ice bucket.
Then, set up a tube rack for each work station.
...

Bacterial Transformation
ExpandIMPORTANT: In addition to wearing the appropriate personal protective equipment, be sure to take care to keep your face ...

Describe how viruses and bacteria transfer genetic material between cells and the role of this process in biotechnology.

A. DNA stores and transmits genetic information. Genes are sets of instructions encoded in the structure of DNA.

B. Genetic information is passed from generation to generation by DNA in all organisms and accounts for similarities in related individuals.

C. Manipulation of DNA in organisms has led to commercial production of biological molecules on a large scale and genetically modified organisms.

D. Reproduction is characteristic of living things and is essential for the survival of species.

Calcium Chloride DNA Uptake in E. coli

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