Name: dna extraction, quantification, and cutting
Uploaded: 2019-01-31T09:26:45.000Z
Duration: 4 min 46 s
Channel: JoVE

K12 Standards

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North Carolina K-12 Science Standard Course of Study

9-12

Biology

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Heredity- Inheritance and Variation of Traits

LS.Bio.8.1

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DNA Isolation and Restriction Enzyme Analysis

La extracción de ADN es la eliminación y purificación del ADN de las células. En primer lugar, las células se lisan, se rompen, generalmente a través de una combinación de alteración física y tratamiento con productos químicos, como un detergente que disuelve la célula y las membranas nucleares. El SDS o dodecil sulfato de sodio es un detergente de uso común que funciona solubilizando las proteínas y lípidos que forman estas membranas. A continuación, el contenido puede flotar libremente en la solución circundante. 

A continuación, el ADN debe separarse de las otras moléculas presentes. La proteinasa K añadida a la reacción romperá los enlaces peptídicos y digerirá las proteínas contaminantes. A continuación, se añade sal a la muestra, que estabiliza los grupos fosfato cargados negativamente en la columna vertebral del ADN y, tras la adición de alcohol helado, precipita el ADN fuera de la solución. El precipitado blanco se recoge haciéndolo girar en una centrífuga donde se deposita en el fondo del tubo. Después de lavarlo y volver a suspenderlo en una solución tampón, el ADN extraído finalmente se puede utilizar en aplicaciones de investigación o biotecnología. 

Algunas aplicaciones de la biotecnología, como la toma de huellas dactilares del ADN, que puede identificar nuevos patrones en el ADN específicos de un individuo o individuos, implican el uso de enzimas de restricción. Las enzimas de restricción son moléculas que interactúan con el ADN y reconocen secuencias específicas. Una vez que se identifica su sitio específico, cortan el ADN. Esto dará como resultado que la hebra se corte en una o más piezas lineales. Si el ADN extraído era un plásmido, una pieza circular de ADN que se encuentra con mayor frecuencia en las bacterias, cualquier corte dará como resultado que el ADN forme un fragmento o fragmentos lineales. Diferentes enzimas de restricción reconocen diferentes secuencias de ADN, por lo que el uso de una combinación de estas puede resultar en la producción de fragmentos distintos. 

En la toma de huellas dactilares de ADN, podemos examinar estos fragmentos utilizando una técnica llamada electroforesis de ADN o electroforesis en gel. Para preparar geles, la agarosa en polvo se mezcla con un tampón y se calienta hasta que se disuelve. A continuación, se añade una tinción de nucleótidos a la mezcla tibia y luego esta solución se vierte en el molde de fundición. Se inserta un peine para formar los pozos. Cuando se solidifica, el gel se transfiere a una caja de gel llena de tampón y se retira el peine. Una mezcla de referencia de fragmentos de ADN teñidos de longitudes conocidas, la escalera de ADN, se añade a un pocillo y las muestras de ADN teñido de interés se cargan en los pocillos restantes. La caja está conectada a una fuente de alimentación y el encendido induce la migración de los grupos fosfato cargados negativamente en los nucleótidos de ADN a través del gel hacia el ánodo, el extremo positivo. Las piezas más pequeñas se mueven más rápidamente que los fragmentos más grandes, que migran con dificultad. 

Cuando se completa la ejecución, el gel se expone a luz ultravioleta para visualizar la tinción de nucleótidos en las muestras de ADN. Su presencia se puede confirmar en función de su ubicación relativa a las bandas de la escalera. Debido a que el ADN con diferentes secuencias tendrá sitios de corte en diferentes ubicaciones, esto puede producir nuevos patrones de bandas, o huellas dactilares, que se pueden usar para distinguir individuos o perfiles de ADN variantes. 

En este laboratorio, realizará extracciones de ADN utilizando un tampón con y sin SDS para evaluar la importancia de los detergentes en el aislamiento del ADN y, a continuación, digerirá el ADN plásmido con diferentes enzimas de restricción para examinar los perfiles de ADN resultantes.

análisis de enzimas de restricción y aislamiento de adn

La revelación del ADN como molécula hereditaria en todos los organismos ha dado lugar a enormes avances científicos y médicos y ha mejorado significativamente nuestra comprensión de nosotros mismos y de otros organismos. El aislamiento y la elaboración de perfiles de ADN han sido los primeros pasos fundamentales para muchos de los avances del siglo pasado; desde la identificación de la función de los genes, hasta las revoluciones de la agricultura y la medicina forense.

<h4>Aislar el ADN de las células</h4>

El aislamiento del ADN es un procedimiento bastante simple que requiere pocos pasos pero esenciales: recolección de células, lisis, degradación de proteínas y, finalmente, precipitación del ADN. Generalmente, el ADN se puede recolectar de pequeñas cantidades de tejido, como una sola hoja de una planta, folículos pilosos de animales o células epiteliales que se pueden desprender fácilmente dentro de la boca con una solución salina simple. Dado que el ADN está compartimentado dentro del núcleo o las mitocondrias dentro de las células eucariotas, los científicos primero rompen la célula y la membrana nuclear para exponer el ADN, lo que se hace con el paso de lisis. Sin embargo, una vez que el ADN está expuesto, puede ser degradado por iones de metales pesados y pH extremo. Por lo tanto, se utiliza una solución tampón que contiene detergente no solo para disolver la membrana celular, sino también para proteger el ADN de los elementos degradantes de la solución. Además, el ADN es una molécula inusualmente larga que se condensa dentro del núcleo al empaquetarse firmemente alrededor de proteínas especiales llamadas histonas. Por lo tanto, se agrega una enzima llamada proteinasa K, que degrada los enlaces peptídicos de las proteínas, para separar el ADN de las histonas y otras proteínas. A continuación, los científicos separan el ADN del resto del extracto celular utilizando sus propiedades químicas. Debido a la estructura cargada negativamente de los ácidos nucleicos, los iones Na+ en una solución de cloruro de sodio se unen e integran en hebras de ADN entrelazadas. Una vez que el ADN está agrupado, se puede observar a simple vista. El ADN es insoluble en alcohol y se precipita fácilmente a bajas temperaturas, por lo que los científicos añaden alcohol frío para precipitar el ADN. Finalmente, el ADN precipitado puede disolverse y almacenarse en agua desionizada o en un tampón suave, libre de cualquier enzima que pueda degradar los ácidos nucleicos, hasta que se utilice.

<h4>Cuantificación del ADN</h4>

Las reacciones que utilizan ADN a menudo requieren una alta pureza y cantidades precisas de ADN. Por lo tanto, después del aislamiento del ADN, los científicos utilizan un espectrofotómetro para cuantificar la cantidad de ADN en su muestra, así como la pureza del ADN en la muestra. Un espectrofotómetro mide la intensidad de un haz de luz que pasa a través de una muestra en función de su longitud de onda. Los ácidos nucleicos absorben la luz a 260 nm, mientras que las proteínas absorben la luz a 280 nm. Al medir la intensidad de un haz de luz a 260 nm, los científicos pueden determinar la concentración de ADN. Además, al evaluar la intensidad de la luz tanto a 260 nm como a 280 nm, se puede determinar la pureza del contenido de ADN. En una muestra de ADN puro, la relación 260/280 nm debe acercarse al valor de 2.

<h4>Enzimas de restricción</h4>

Para una serie de análisis, como la clonación, la secuenciación y el mapeo de fragmentos de ADN y genomas, el ADN aislado debe cortarse en secuencias específicas utilizando enzimas de restricción. Estas enzimas son producidas por las bacterias como mecanismos de inmunidad innata contra el ADN viral intruso y funcionan como tijeras moleculares. Por lo tanto, después de que las enzimas de restricción identifican un ADN viral, comienzan a descomponerlo cortándolo en segmentos en ciertas secuencias de nucleótidos que reconocen. Estas secuencias de nucleótidos suelen tener de seis a doce nucleótidos de largo y generalmente son palindrómicas, lo que significa que tienen la misma secuencia de nucleótidos en las direcciones 3'-5' y 5'-3'. Por ejemplo, la enzima de restricción EcoRI corta el ADN en la secuencia 3'... GAATTC...-5', que se lee igual en la dirección 5'-3'. Al igual que EcoRI, hay cientos de enzimas que corresponden a muchas secuencias palindrómicas distintas. Una vez que el ADN es cortado por estas enzimas, los científicos pueden cargar el ADN en un gel en una cámara de electroforesis y pasar corriente eléctrica a través del gel. El ADN lleva cargas negativas, lo que hace que los fragmentos de ADN migren hacia el ánodo. Sin embargo, los poros del gel ralentizan los fragmentos de ADN más grandes en relación con las secuencias de ADN más pequeñas, por lo que las piezas se separan según su tamaño. Después de la finalización de la electroforesis, los fragmentos de ADN se pueden visualizar con la ayuda de tintes que se unen específicamente a las moléculas de ADN.

El corte de ADN con enzimas de restricción y la separación de fragmentos de ADN con electroforesis permite a los investigadores identificar los tamaños de fragmentos desconocidos en relación con una escalera estándar. Estos fragmentos de interés pueden aislarse aún más y ligarse en un vector plásmido para la clonación genética. La ingeniería genética y los análisis de laboratorio han mejorado enormemente con estos métodos. Con el perfil de ADN, los científicos pueden secuenciar genomas para comprender mejor el funcionamiento de los organismos y también pueden identificar y caracterizar ciertos genes.

El aislamiento y la elaboración de perfiles de ADN también son prácticos para eventos que afectan directamente a la vida cotidiana. Por ejemplo, los científicos forenses analizan rutinariamente muestras de ADN para proporcionar evidencia para casos penales y civiles2. Del mismo modo, los trabajadores de la salud extraen y analizan el ADN para verificar la paternidad y las enfermedades genéticas. Recientemente, los kits de análisis de ascendencia de ADN se hicieron populares al permitir a los usuarios determinar su linaje genético, encontrar parientes e incluso descubrir su disposición genética adiversas condiciones de salud. Por último, con los avances en biotecnología e ingeniería genética, la medicina personalizada está ganando terreno entre los investigadores clínicos para desarrollar tratamientos utilizando los datos genéticos de un individuo, allanando el camino para tratar eficazmente a los pacientes sin efectos secundarios perjudiciales.

<h4>Referencias</h4>

<ol class="referencias">
	<li>Chambers, GK, et al. Huellas dactilares de ADN en zoología: pasado, presente, futuro. Investig Genet. 2014, Vol. 5, 3 doi: 10.1186/2041-2223-5-3.</li>
	<li>Roewer, L. Huellas dactilares de ADN en medicina forense: pasado, presente, futuro. Investig Genet. . 2013, Vol. 4, 22 doi: 10.1186/2041-2223-4-22.</li>
	<li>Kirkpatrick, BE y Rashkin, MD. Pruebas de ascendencia y la práctica del asesoramiento genético. J Gen Consejería. 2016, Vol. 26, 1 (6-20).</li>
	<li>Hamburgo, MA y Collins, FS. El camino hacia la medicina personalizada. N Engl J Med . 2010; , Vol. 363, 301-304.</li>
</ol>

Análisis de enzimas de restricción y aislamiento de ADN

La revelación del ADN como molécula hereditaria en todos los organismos ha dado lugar a enormes avances científicos y médicos y ha mejorado significativamente nuestro ...

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JoVE Lab Manual

Biología

Genetics

Genética

dna extraction, quantification, and cutting

DNA extraction, quantification, and cutting are key steps in many biology labs. Scientists use these methods to study genes, prepare DNA for testing, and compare fragments for analysis.

DNA isolation starts with a small sample, such as a leaf, hair follicles, or epithelial cells from the mouth collected with a saline solution. The first steps are cell harvesting, lysis, protein degradation, and DNA precipitation. Lysis breaks open the cell and nuclear membranes so the DNA can be released from the nucleus or mitochondria in eukaryotic cells. A detergent-containing buffer helps dissolve membranes and also protects DNA from degrading conditions such as heavy metal ions and extreme pH.

After the DNA is exposed, Proteinase K is added. This enzyme breaks peptide bonds in proteins and helps separate DNA from histones and other proteins. The DNA is then mixed with sodium chloride, and Na+ ions help the tangled DNA strands clump together because nucleic acids carry negative charges. Cold alcohol is added next, since DNA does not dissolve in alcohol and will precipitate at low temperatures. The DNA can then be dissolved in deionized water or a mild buffer for storage, as long as the solution is free of enzymes that could break it down.

Once DNA is isolated, scientists often measure how much DNA they have and how pure it is. A spectrophotometer does this by sending light through the sample at specific wavelengths. DNA absorbs light at 260 nm, while proteins absorb light at 280 nm. The 260 nm reading shows DNA concentration, and the 260/280 ratio helps estimate purity. In a sample of pure DNA, that ratio should approach 2.

For cloning, sequencing, and mapping DNA fragments or genomes, scientists often need to cut DNA at specific sites. They use restriction enzymes, which are bacterial proteins that act like molecular scissors against invading viral DNA. These enzymes recognize short nucleotide sequences, often six to twelve bases long, and the sequences are usually palindromic, meaning they read the same in both directions. EcoRI is one example and cuts at the sequence GAATTC.

After cutting, the DNA fragments are loaded into a gel and separated by electrophoresis. DNA is negatively charged, so it moves toward the anode when an electric current is applied. Smaller fragments travel faster through the gel pores than larger ones, so the pieces separate by size. Dyes that bind to DNA make the fragments visible, and researchers compare them with a standard ladder to estimate fragment size. The fragments can then be isolated and ligated into a plasmid vector for genetic cloning.

These methods support many modern applications. Scientists use DNA profiling to sequence genomes and to identify and study genes. DNA analysis also helps in forensics for criminal and civil cases, in paternity testing, and in checks for genetic diseases. Ancestry kits use DNA to help people trace lineage, find relatives, and learn about possible health traits. These tools also support personalized medicine, where researchers use a person’s genetic data to design treatments with fewer harmful side effects.

DNA Extraction, Quantification, and Cutting

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genetics of organisms

Mendelian Traits and Exceptions

Mendelian genetics explains how traits move from parents to offspring. Gregor Mendel studied pea plants in 1865 and showed that many visible traits are controlled by two alleles, or gene versions, with one inherited from each parent. He also found that some alleles are dominant and others are recessive. Mendel’s work was not widely accepted until 1900, and it took about 30 more years for Mendelian inheritance to fit into evolutionary theory. One reason for the delay was that real breeding...

dna isolation and restriction enzyme analysis

DNA extraction, quantification, and cutting are key steps in many biology labs. Scientists use these methods to study genes, prepare DNA for testing, and compare fragments for analysis. DNA isolation starts with a small sample, such as a leaf, hair follicles, or epithelial cells from the mouth collected with a saline solution. The first steps are cell harvesting, lysis, protein degradation, and DNA precipitation. Lysis breaks open the cell and nuclear membranes so the DNA can be released from...

bacterial transformation

Plasmid DNA Transfer in Bacteria

Plasmid DNA transfer in bacteria helped launch modern genetic engineering. The idea traces back to Frederick Griffith’s work on pneumonia-causing Streptococcus pneumoniae in the early 20th century. He studied a rough, non-virulent R strain and a smooth, virulent S strain with a protective polysaccharide capsule. When he injected mice with heat-killed bacteria of either strain, the mice survived. But when heat-killed S-strain bacteria were mixed with live R-strain bacteria, the mice died, and...

genetics

Learn how DNA is isolated, measured with a spectrophotometer, cut with restriction enzymes, and separated by gel electrophoresis for analysis.

DNA Extraction, Quantification, and Cutting | JoVE K12

Prepárese para enseñar Análisis de enzimas de restricción y aislamiento de ADN con esta guía para instructores de 2 minutos. Cubre los pasos clave de preparación para el laboratorio Biology en JoVE Lab Manual.

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Siga los procedimientos paso a paso de Análisis de enzimas de restricción y aislamiento de ADN en este video de protocolo estudiantil de 13 minutos. Parte de la colección Biology en JoVE Lab Manual.

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During embryogenesis, cells become progressively committed to different fates through a two-step process: specification followed by determination. ...

Use models to explain how DNA is passed from parents to offspring through the processes of meiosis and fertilization in sexual reproduction.

LS.Bio.6.1

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Mutations are changes in the sequence of DNA. These changes can occur spontaneously or they can be induced by exposure to environmental factors. Mutations ...

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Genome Size and the Evolution of New Genes

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Types of Genetic Transfer Between Organisms

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DNA replication has three main steps: initiation, elongation, and termination. Replication in prokaryotes begins when initiator proteins bind to the ...

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In eukaryotic cells, DNA replication is highly conserved and tightly regulated. Multiple linear chromosomes must be duplicated with high fidelity before ...

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Organisms are capable of detecting and fixing nucleotide mismatches that occur during DNA replication. This sophisticated process requires identifying the ...

Fixing Double-strand Breaks

Homologous Recombination

Gene Conversion

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Construct an explanation to summarize how inheritable genetic variations may result from: new genetic combinations in meiosis, mutations during replication, or mutations caused by environmental factors.

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An organism&#8217;s physical traits, or phenotype, are a product of its genotype, which is the combination of alleles (gene variants) inherited from its ...

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To dissect genetic processes or create organisms with novel suites of traits, scientists can perform genetic crosses, or the purposeful mating of two ...

Punnett Squares

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Trihybrid Crosses

Trihybrid Crosses
Some of Mendel&#8217;s crosses examined three pairs of contrasting characteristics. Such a cross is called a trihybrid cross. A ...

Law of Independent Assortment

Chi-square Analysis

The chi-square test is a statistical hypothesis test. It is used to check whether there is a significant difference between an expected value and an ...

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Gregor Mendel&#39;s work (1822 - 1884) was primarily focused on pea plants. Through his initial experiments, he determined that every gene in a diploid ...

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Agouti: A Lethal Allele
Lucien Cu&#233;not discovered lethal alleles in 1905 while studying the inheritance of coat color in mice. The agouti gene is ...

Polygenic Traits

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Background and Environment Affect Phenotype

Although the genetic makeup of an organism plays a major role in determining the phenotype, there are also several environmental factors, such as ...

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Multiple allelism describes genes that exist in three or more allelic forms. Although diploid organisms, like humans, ...

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Agarose gel electrophoresis is a laboratory technique commonly used to separate DNA fragments by size. However, it can also be used to isolate and purify ...

The revelation of DNA as the hereditary molecule in all organisms has led to enormous scientific and medical breakthroughs and significantly enhanced our ...

Preparation of Solutions and Materials
ExpandNOTE: For this lab to run smoothly, it is recommended to not exceed 12 samples per laboratory class.
First ...

DNA Isolation
ExpandNOTE: In this experiment you will perform DNA isolation under two experimental conditions: one using a buffer containing the detergent ...

Analyze and interpret data to compare DNA samples.

Transgenic Organisms

Reproductive Cloning

CRISPR

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Synthetic biology is an interdisciplinary science that involves using principles from disciplines such as engineering, molecular biology, cell biology, ...

Ribosome Profiling

Ribosome profiling or ribo-sequencing is a deep sequencing technique that produces a snapshot of active translation in a cell. It selectively sequences ...

Transgenic Plants

Recombinant DNA technology called transgenesis is often used to add a foreign gene or remove a detrimental gene from an organism. Such genetically ...

Gene Therapy

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Biofuels: Producing Ethanol from Cellulosic Material

Source: Laboratories of Margaret Workman and Kimberly Frye - Depaul University
In this experiment, cellulosic material (such as corn stalks, leaves, ...

Testing For Genetically Modified Foods

Source: Laboratories of Margaret Workman and Kimberly Frye - Depaul University
Genetic modification of foods has been a controversial issue due to debated ...

Obtain and communicate information that summarizes the impact of biotechnology applications on the individual, society, and the environment, including agriculture and medicine.

LS.Bio.8.2

Understand genetic mechanisms for variation.

DNA Extraction, Quantification, and Cutting

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