RNAi en C. elegans

ARN de interferencia o ARNi, es una técnica ampliamente utilizada que RNA trenzado doble es que te presenten a un organismo, lo que resulta en el silenciamiento de genes específicos. El Premio Nobel ganador descubrimiento de interferencia del ARN permitió investigadores silenciar cualquier gen C. elegans para determinar su función. Podemos inducir RNAi en la C. elegans por primeras placas preparación con e. coli que expresan objetivo gene dsRNA, que comen los gusanos. Luego, 4 larvas gusanos se transfiere a las placas de RNAi y permitió a poner huevos. En el escenario deseado de desarrollo de la progenie se recogen y se anotó para fenotipos.

Tecnología de RNAi se utiliza con frecuencia en C. elegans para realizar pantallas genéticas reversas, pantallas automatizadas de alto rendimiento y como una herramienta para el estudio de procesos de desarrollo. En este video, nos explican el concepto de interferencia de ARN, muestran cómo utilizar la técnica de RNAi en la C. elegans y discutir cómo los científicos están utilizando RNAi como una herramienta para entender mejor los procesos biológicos generalizados.

Vamos a empezar por la primera que muestra cómo funciona la interferencia de ARN. En el caso de C. elegans, los gusanos se alimentan las bacterias, que han sido transformadas con plásmidos que código de doble trenzado RNA complementario a los genes que quiere silenciar. Como se mencionó anteriormente, C. elegans se alimentan de las bacterias transformadas. A través de un mecanismo actualmente desconocido, dsRNA entra en C. elegans del tejido una vez ingerido.

Una vez dentro de la célula, la enzima Dicer hiende el RNA trenzado doble en corto ARN interferente, o siRNA, que es entre los 21 y 23 nucleótidos de largo. A continuación, el siRNA asociados con el ARN inducido silenciando complejo, también conocido como &quo; RISC &quo; y se convierte en desenrollado. Entonces, el complejo de siRNA/RISC se une el blanco mRNA mediante apareamiento complementario de la base. Esto conduce a la degradación del mRNA, derribar lo que el gen.

Antes de comenzar el procedimiento, la bacteria expresa el RNA trenzado doble de interés necesita ser preparado. Las bibliotecas de las bacterias que contienen plásmidos dsRNA de codificación para los millares de genes son disponibles en el mercado. De lo contrario, la secuencia del gene blanco necesita ser clonado en un plásmido mediante técnicas de clonación estándar. El plásmido contiene un gen de resistencia a lo antibióticos ampicilina, que se puede utilizar para seleccionar las colonias bacterianas que contienen el plásmido.

A continuación, utilizar técnicas estándar para transformar el plásmido codificación el dsRNA de interés en la cepa (DE3) de las bacterias e. coli que expresará el ARN bicatenario. Además, transformar las bacterias con un plásmido vacío como control. Lo importante, la cepa de e. coli utilizada en estos experimentos carece de ARN polimerasa III, que sería lo contrario RNA trenzado doble recopilación. Esta bacteria también contiene un gene inducible del IPTG para polimerasa de la DNA T7, que transcribe el dsRNA en el plásmido. Por último, las bacterias (DE3) son tetraciclina y carbenicilina resistente, para mantener la expresión de RNA polimerasa III y prevenir el crecimiento bacteriano no deseado.

Trasmitir las bacterias transformadas de HT115(DE3) en placas de agar LB que contiene 12.5 μg/ml tetraciclina y 25 carbenicilina μg/ml. Incubar durante una noche a 37 ° C y las colonias bacterianas de la mañana siguiente estará presentes en las placas. Luego, seleccionar una colonia de bacterias individuales y añadir 1 ml de LB caldo que contiene 100 μg/ml de ampicilina para seleccionar las bacterias que contienen el plásmido. Incubar durante una noche a 37 ° C con agitación. Después de la incubación durante la noche, añadir 5 ml de LB caldo que contiene 100 μg/ml de ampicilina a la cultura e incubar por 4-6 horas a 37 ° C.

Una vez que las bacterias están listas, placas de ARNi gusano necesitan ser preparado para la alimentación. Arni gusano planchas contienen: agar, agua, carbenicilina, medio mezcla de gusano y IPTG para inducir la polimerasa T7 DNA en las bacterias que transcribe el dsRNA en el plásmido. Añadir 0,5 ml de cultivo de bacterias a las placas de gusano ARNi e incubar durante una noche a 37 ° C, creando un césped bacteriano.

Antes de añadir lombrices a las placas de ARNi, es importante sincronizar la etapa de desarrollo del gusano, para que las diferencias observadas en fenotipo no son un artefacto de la etapa de desarrollo. Para sincronizar las etapas de desarrollo, en primer lugar llama-esterilizar un pick de alambre de platino.

Usar el pick de gusano para añadir L4 gusanos a cada placa de RNAi e incubar durante una noche a 20 ° C, lo que les permite convertirse en jóvenes adultos ponedora. A continuación, transferencia de jóvenes a la nueva placa de ARNi e incubar durante 6-8 horas a 20 ° C, durante el cual se colocan los huevos. Una vez que se eliminan todos los adultos, se sincronizarán con estos huevos. Finalmente, permita que gusanos que crecen en las placas de ARNi hasta que hayan alcanzado la etapa de desarrollo de interés para el análisis.

Para poder visualizar los gusanos, una diapositiva debe ser preparada con una almohadilla de agar al 4%. En primer lugar, la cinta 2 portaobjetos de vidrio con etiqueta de la cinta, creando a separadores que garantizan el espesor uniforme de la almohadilla de agar. Colocar un portaobjetos de vidrio limpio entre los dos separadores y pipeta sobre 150 μl de 4% agar fundido en la diapositiva. Cubrir rápidamente el agar fundido con la perpendicular a los espaciadores adicional diapositiva. Separe suavemente el portaobjetos y la almohadilla de agar se adhirió a una de las diapositivas.

A continuación, añadir 10 μl de un anestésico como la azida de sodio en el plato de agar para inmovilizar a los animales. Utilizando una púa de alambre de platino, transferencia de gusanos a la placa de agar con anestésico y añadir un cubreobjetos. Finalmente, observar gusanos bajo un microscopio. Gusanos que han tenido caída de gene de RNAi con controles y nota las diferencias en tamaño, etapa de desarrollo, morfología, patrones de localización de proteínas fluorescencia de etiquetado y otros fenotipos posibles de comparar.

Una de las aplicaciones más valiosas de ARN de interferencia es la capacidad de realizar fácilmente pantallas genéticas inversas. Una pantalla genética inversa es un enfoque para descubrir función genética derribando una conocida colección de genes y evaluando el resultado fenotípico. Por ejemplo, los investigadores pueden utilizar una biblioteca de bacterias que expresan dsRNA para casi todos los genes en el genoma de C. elegans . Estas bacterias son cultivadas en placas de varios pocillos y alimenta a los gusanos. Entonces, los efectos fenotípicos de la caída de muchos genes en el ARNi pueden evaluarse, dando la penetración en las funciones de un gen normal in vivo.

Pantallas genéticas automáticas son un tipo de pantalla genética reversa que son de muy alto rendimiento. En automatizado pantallas genéticas, el entero C. elegans genoma puede ser derribado muy fácilmente utilizando robotizada manipulación de los miles de clones bacterianos y utilizando instrumentos especializados para el análisis cuantitativo.

Por ejemplo, gusanos que expresan el péptido antimicrobiano gene PNL 29, reportero fluorescente transgénico están sujetos a ARNi caída de miles de genes a través de alimentación bacteriana. Al mismo tiempo, los gusanos se introducen en las esporas de hongos. Entonces, puede evaluarse la respuesta al péptido antimicrobiano para hongo.

Desarrollo de C. elegans es estudiada con frecuencia mediante RNAi. Los científicos pueden utilizar ARN de interferencia para derribar cualquier gen o conjunto de genes de interés y evaluar exactamente cómo eso gene afecta procesos durante el desarrollo o momento del desarrollo. Por ejemplo, caída de RNAi puede revelar genes eso retraso desarrollo cuando, o genes implicados en el desarrollo del órgano.

Sólo ha visto la introducción de Zeus a la interferencia de RNA en C. elegans. Repasamos cómo funciona el ARN de interferencia y cómo utilizar el RNA de interferencia en C. elegans mediante alimentación bacteriana. ARN de interferencia es una valiosa herramienta para las pantallas genéticas inversas, incluyendo pantallas automáticas de alto rendimiento y es también una herramienta útil para el estudio de desarrollo. ¡Gracias por ver!