División celular

1. Observando el ciclo celular en una punta de raíz Expand
   • Hipótesis: La hipótesis experimental es que en las rodajas de las puntas de las raíces que han sido tratadas con nocodazol, un químico que interfiere con la polimerización microtubular, todas las células se detendrán en la misma etapa del ciclo celular y que en las rodajas de punta de cebolla sin tratar se visualizarán todas las diferentes etapas del ciclo celular. La hipótesis nula es que no habrá diferencias en la mitosis entre los dos grupos y que se visualizarán diferentes etapas del ciclo celular.
   • Para prepararse para este experimento, utilizará una cebolla que se ha colocado en agua durante varios días hasta que hayan comenzado a brotar nuevas puntas de raíz blancas. Usa una cuchilla de afeitar para cortar un trozo de 1 cm desde el extremo de una de las puntas de las raíces.
   • Coloque la rodaja de cebolla en un tubo de microcentrífuga marcado con "N" para la condición de nocodosazol.
   • Luego, corte un segundo trozo de 1 cm de punta de raíz de cebolla y colóquelo en un tubo de microcentrífuga etiquetado como "C" para la condición de control.
   • Agregue 2 μL de los 5 mg/mL de nocodazol a 1 mL de agua en el tubo de microcentrífuga marcado con N y 1 mL de agua solo al tubo marcado con C.
   • Deje incubar los tubos que contienen las puntas de las raíces durante 12 horas y limpie el espacio de trabajo con etanol al 70%.
   • Cuando se complete la incubación, ajuste un bloque de calor a 60 ºC.
   • Lave las puntas tratadas con nocodazol con agua y luego aspire el líquido.
   • Repita este lavado dos veces más, para un total de tres lavados.
   • Llene ambos tubos con 1 mL de un ácido clorhídrico normal. Incubar los tubos en un bloque térmico a 60 ºC durante 12 - 15 min, luego desechar el ácido en un matraz de desechos.
   • Ahora, agregue 1 mL de agua destilada gota a gota a los tubos al menos tres veces para enjuagar las muestras.
   • Ahora agregue un microlitro de tinción DAPI a 10 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS).
   • Luego coloque 50 μL de esta tinción diluida de DAPI en cada tubo, y déjelos a temperatura ambiente para incubar durante 12 min.
   • Después de esto, realice tres lavados con agua destilada como en el paso 10.
   • Etiquete un portaobjetos de microscopio como 'Control' y otro como 'Nocodazol'.
   • Transfiera las raíces teñidas a sus respectivos portaobjetos de microscopio y añada una gota de agua al portaobjetos de control y una gota de nocodazol al portaobjetos de nocodazol.
   • Utilice la cuchilla de afeitar para eliminar las partes no manchadas de cada punta de la raíz y coloque una cubierta de vidrio sobre cada muestra.
   • Presione cuidadosamente cada cubreobjetos con la yema de un dedo enguantado, y luego deje reposar los portaobjetos durante 10 min.
   • Finalmente, vea los portaobjetos bajo el objetivo 40X de un microscopio de fluorescencia y capture imágenes de sus preparaciones de células de punta de raíz.
2. Entendiendo la Pérdida del Control del Ciclo Celular Expand<ul class="lab-items">
3. NOTA: Antes de que las células puedan pasar por todas las etapas del ciclo celular, hay varios puntos de control por los que deben pasar. Estos puntos de control están regulados por la ciclina y las proteínas quinasas dependientes de ciclina, o CDK. Si las ciclinas y las CDK determinan que los eventos celulares anteriores no se han completado adecuadamente, detendrán las células en este paso y evitarán que proliferen. En las células cancerosas, una o varias de estas restricciones moleculares para regular la división celular se pierden y esto permite que las células dañadas escapen del control de la proliferación celular. Estas células anormales se convierten en tumores, que son masas de células proliferantes descontroladas que interfieren con las funciones normales del cuerpo. Observe cómo, antes de dividirse, esta célula cancerosa se agrupa y refracta la luz con mucha fuerza bajo el microscopio óptico. Esto se debe a que no todas las células cancerosas se dividen con éxito en células hijas después de cada ronda de mitosis. Esto significa que a menudo contienen un exceso de orgánulos y ADN, y este aumento en el contenido celular significa que refractarán la luz más intensamente que las células normales.
4. Resultados Expand<ul class="lab-items">
5. Examine sus imágenes recolectadas y registre en la Tabla 1 las diferentes estructuras celulares y etapas que se pudieron identificar en la rodaja de punta de cebolla que fue tratada con nocodazol. Haga clic aquí para descargar la Tabla 1
6. Si hay alguna célula en mitosis, fíjate en las etapas de división celular que ves.
7. Registre el porcentaje de células en cada etapa de mitosis en la Tabla 1.
8. A continuación, examine las imágenes de la rodaja de punta de cebolla sin tratar y registre qué estructuras celulares puede identificar.
9. Si hay alguna célula en mitosis, considere qué etapas de división celular ve y registre los porcentajes de células en cada etapa de mitosis en la Tabla 1.

La hipótesis experimental es que en las rodajas de las puntas de las raíces que han sido tratadas con nocodazol, un químico que interfiere con la polimerización microtubular, todas las células se detendrán en la misma etapa del ciclo celular y que en las rodajas de las puntas de cebolla no tratadas se visualizarán todas las diferentes etapas del ciclo celular. La hipótesis nula es que no habrá diferencias en la mitosis entre los dos grupos y que se visualizarán diferentes etapas del ciclo celular. Para prepararse para este experimento, utilizará una cebolla que se haya colocado en agua durante varios días hasta que comiencen a brotar nuevas puntas de raíz blancas.

Usa una hoja de afeitar para cortar un trozo de un centímetro desde el extremo de una de las puntas de la raíz. Coloque la rodaja de cebolla en un tubo de microcentrífuga marcado con N para la condición de nocodazol. Luego corte un segundo trozo de un centímetro de punta de raíz de cebolla y colóquelo en un tubo de microcentrífuga etiquetado como C para la condición de control.

Agregue dos microlitros de cinco miligramos por mililitro de nocodazol a un mililitro de agua en el tubo de microcentrífuga etiquetado con N y un mililitro de agua al tubo etiquetado como C. Deje incubar los tubos que contienen las puntas de las raíces durante 12 horas y limpie el espacio de trabajo con etanol al 70%. Cuando se complete la incubación, coloque un bloque de calor a 60 grados centígrados. Lave las puntas tratadas con nocodazol con agua y luego aspire el líquido.

Repita este lavado dos veces para un total de tres lavados. Llene ambos tubos con un mililitro de un ácido clorhídrico normal. Incube los tubos en un bloque de calor a 60 grados centígrados durante 12 a 15 minutos, luego deseche el ácido en un matraz de desecho y agregue un mililitro de agua destilada gota a gota a los tubos al menos tres veces para enjuagar las muestras.

Ahora agregue un microlitro de tinción de DAPI a 10 mililitros de solución salina tamponada con fosfato. A continuación, coloque 50 microlitros de la tinción diluida de DAPI en cada tubo y déjelos a temperatura ambiente para incubar durante 12 minutos. Después de esta preforma, tres lavados con agua destilada como se acaba de demostrar.

Etiquete un portaobjetos de microscopio como Control y otro como Nocodazol. Transfiera las raíces teñidas a sus respectivos portaobjetos de microscopio y agregue una gota de agua al portaobjetos de control y una gota de nocodazol al portaobjetos de nocodazol. Use la hoja de afeitar para quitar las partes no manchadas de cada punta de la raíz y coloque una cubierta de vidrio sobre cada muestra.

Presione con cuidado cada cubreobjetos con la punta de los dedos enguantados y luego deje reposar los portaobjetos durante 10 minutos. Finalmente, vea los portaobjetos bajo el objetivo de 40x de un microscopio óptico o fluorescente y capture imágenes de sus preparaciones de células de punta de raíz. Antes de que las células puedan pasar por todas las etapas del ciclo celular, hay varios puntos de control por los que deben pasar.

Estos puntos de control están regulados por la ciclina y las proteínas quinasas dependientes de ciclina, o CDK. Si las ciclinas y las CDK determinan que los eventos celulares anteriores no se han completado adecuadamente, detendrán las células en este paso y evitarán que proliferen. En las células cancerosas, una o varias de estas restricciones moleculares para regular la división celular se pierden y esto permite que las células dañadas escapen del control de la proliferación celular.

Estas células anormales se convierten en tumores, que son masas de células proliferantes descontroladas que interfieren con las funciones normales del cuerpo. Observe cómo, antes de dividirse, esta célula cancerosa se agrupa y refracta la luz con mucha fuerza bajo el microscopio óptico. Esto se debe a que no todas las células cancerosas se dividen con éxito en células hijas después de cada ronda de mitosis.

Esto significa que a menudo contienen un exceso de orgánulos y ADN, y este aumento en el contenido celular significa que refractarán la luz más intensamente que las células normales. Ahora que se han recopilado todos los datos, echemos un vistazo a nuestros resultados. ¿Qué estructuras celulares se pueden identificar en la rodaja de punta de cebolla que fue tratada con nocodazol?

¿Hay alguna célula en proceso de mitosis? ¿Qué etapas de la división celular observas? Registre el porcentaje de células en cada etapa de la mitosis en la tabla.

A continuación, mire la rodaja de punta de cebolla sin tratar. ¿Qué estructuras celulares puedes identificar? ¿Hay alguna célula en proceso de mitosis?

¿Qué etapas de la división celular observas? Registre los porcentajes de células en cada etapa de la mitosis en la tabla. Habrá notado que la mayoría de las células en la rodaja de cebolla tratada con nocodazol se encuentran en la misma etapa de mitosis debido a las propiedades de alteración de microtúbulos del reactivo que impiden la formación de las fibras del huso y la posterior segregación cromosómica y división celular.

Sin embargo, muchas etapas diferentes de la mitosis son visibles en las células de la rebanada no tratada, ya que la mitosis es un proceso continuo en organismos sanos.