15.13: ADN complementario

Descripción general

Sólo los genes que se transcriben en ARN mensajero (ARNm) están activos o se expresan. Por tanto, los científicos pueden extraer el ARNm de las células para estudiar la expresión genética en diferentes células y tejidos. El científico convierte el ARNm en ADN complementario (ADNc) mediante transcripción inversa. Debido a que el ARNm no contiene intrones (regiones no codificantes) ni otras secuencias reguladoras, el ADNc, a diferencia del ADN genómico, también permite a los investigadores determinar directamente la secuencia de aminoácidos del péptido codificado por el gen.

Síntesis de ADNc

El ADNc se puede generar mediante varios métodos, pero una forma común es extraer primero el ARN total de las células y luego aislar el ARNm de los tipos más predominantes,ARN de transferencia (ARNt) y ribosómico (ARNr). El ARNm eucariótico maduro tiene una cola poli(A),una cadena de nucleótidos de adenina, agregada a su extremo 3', aunque otros tipos de ARN no la tienen. Por lo tanto, se puede unir una cadena de nucleótidos de timina (oligo-dT) a un sustrato como una columna o perlas magnéticas, para emparejar específicamente las bases con las colas poli(A) del ARNm. Mientras se captura el ARNm con una cola poli(A), los otros tipos de ARN se eliminan por lavado.

A continuación, se utiliza la transcriptasa inversa,una enzima ADN polimerasa de los retrovirus,para generar ADNc a partir del ARNm. Dado que, como la mayoría de las ADN polimerasas, la transcriptasa inversa puede agregar nucleótidos solo al extremo 3' de una cadena, se agrega un cebador poli(T) para unirse a la cola poli(A) y proporcionar un punto de partida para la síntesis de ADNc. La cadena de ADNc termina en un bucle en forma de horquilla. Luego, el ARN se degrada,comúnmente con tratamiento alcalino o enzimas RNasa,dejando intacto el ADNc monocatenario.

Luego, la ADN polimerasa sintetiza una segunda hebra de ADN complementaria al ADNc, a menudo utilizando el bucle en horquilla de la primera hebra de ADNc o un trozo mellado del ARNm como cebador.

El ADNc bicatenario resultante puede insertarse en vectores bacterianos o virales y clonarse utilizando técnicas de biología molecular estándar. También se puede construir una biblioteca de ADNc, que represente todos los ARNm de las células o tejidos de interés, para investigaciones adicionales.

- [Narrador] Casi todas las células contienen el mismo ADN

pero algunas, como las neuronas y las fibras musculares,

expresan genes diferentes

porque solo algunos genes son transcritos

en ARN mensajero, o ARNm, en cada célula.

En el laboratorio, los ARNm son utilizados como un modelo

para sintetizar ADN complementario, o ADNc,

para estudiar la expresión genética.

Un método común es extraer ARN de las células,

luego aislar el ARNm de los otros tipos de ARN,

como ARN ribosomal o ARN de transferencia,

dejando pasar la muestra por una columna de cuentas

con segmentos de nucleótidos de timina asociados.

Estos se unen al extremo poli-A,

una cadena de nucleótidos de adenina específicamente

presente en las terminaciones prima-3 de ARNm eucarionte.

Los otros ARN no se unen y son arrastrados con la muestra.

Después de aislar el ARNm,

un cebador poli-T se une al extremo poli-A,

siendo un origen para que la enzima transcriptasa inversa

transcriba una cadena sencilla de ADNc a partir del ARNm.

Químicos, como las enzimas ribonucleasas,

se añaden despúes para degradar el ARN.

Entonces se utilizan enzimas polimerasas de ADN

para sintetizar una cadena complementaria para el ADNc,

obteniendo una cadena doble de ADNc,

el cual puede ser insertado en un vector bacterial o viral

y utilizado en investigaciones de biología molecular.