15.10:

15.10: RT-PCR en tiempo real

Real Time RT-PCR

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Molecular Biology

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JoVE Core Molecular Biology

Real Time RT-PCR

15.9: PCR – Polymerase Chain Reaction

15.11: RACE – Rapid Amplification of cDNA Ends

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02:57 min

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April 07, 2021

Overview

Real-time reverse transcription-polymerase chain reaction, or Real-time RT-PCR, is an analytical tool used to determine the expression level of target genes. The method involves converting mRNA to complementary DNA with the help of an enzyme known as reverse transcriptase, followed by the PCR amplification of the cDNA. These two processes can be performed simultaneously in a single tube or separately as a two-step reaction.

The real-time quantification of the number of amplified products is carried out either using fluorescent dyes or sequence-specific probes linked to a fluorophore. The fluorescent dyes used in this case can specifically bind to double-stranded DNA and exhibit fluorescence only when bound to DNA. Fluorescence is measured at the end of each PCR cycle after the synthesis of the complementary strand. In the case of fluorophore-labeled probes, fluorescence is exhibited when the fluorophore is cleaved from the probe during the synthesis of the complementary strand. Fluorescence exhibited by these molecules is then detected by photodetectors that convert the fluorescence signals to a readable format. Real-time RT-PCR requires a specialized PCR machine equipped with a detector to enable real-time quantification, as a traditional PCR machine is not equipped for such analysis.

The output can be analyzed in a number of ways. One way is to count the number of cycles required for the fluorescence to reach detectable levels. The threshold cycle, denoted by C_t, is when the fluorescence is detected over and above the background noise. The greater the quantity of the target in the starting material, the faster the significant increase in fluorescence will appear, resulting in a lower C_t.The C_t value finds application in the downstream quantification or detection of the presence or absence of the target sequence. Additionally, comparing the C_t values of samples of unknown concentration with a series of C_t values obtained from standard concentration can determine the amount of template in an unknown reaction. This is known as absolute quantification and can also be carried out by comparing the fluorescence to a standard curve prepared using known DNA concentrations.

Transcript

La reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa en tiempo real, o RT-PCR en tiempo real, puede cuantificar un ARN de interés a medida que avanza la reacción.

Para empezar, la transcriptasa inversa copia el ARN en complementario, o ADNc. La ARNasa H digiere el ARN original, dejando pequeños cebadores unidos al ADNc.

A continuación, la ADN polimerasa sintetiza una hebra complementaria.

A continuación, se puede llevar a cabo una amplificación dirigida mediante PCR para crear copias exponenciales de segmentos específicos. Las dos hebras se separan al comienzo de cada ciclo a altas temperaturas. Los cebadores de oligonucleótidos complementarios se recocen a cada cadena de ADNc y son extendidos por la ADN polimerasa.

El ADN se puede cuantificar utilizando uno de dos métodos diferentes de detección basados en fluorescencia. Un método utiliza tintes que solo emiten fluorescencia cuando se unen a ADN bicatenario.

El tinte se une al ADN, donde la hebra original se empareja con una hebra complementaria recién sintetizada. Al final de cada ciclo de PCR, una longitud de onda de luz adecuada excita el colorante unido.

El otro método utiliza sondas de oligonucleótidos complementarias específicas de secuencia unidas a un fluoróforo y una molécula extinguidora.

La reacción se expone continuamente a una longitud de onda de luz adecuada, y la molécula extingudora absorbe la fluorescencia del fluoróforo cuando están cerca unas de otras. La ADN polimerasa desprende el fluoróforo durante la extensión, evitando el enfriamiento.

El método basado en sondas es específico, ya que solo se conecta a la secuencia objetivo. Por el contrario, el método basado en colorantes es inespecífico y se une a todo el ADN bicatenario.

En cualquier caso, la fluorescencia emitida por el fluoróforo excitado es detectada por fotodetectores que convierten las señales recibidas en una salida digital.

El ciclo umbral, o Ct, es el número de ciclos de PCR para que la fluorescencia alcance un nivel establecido muy por encima de la fluorescencia de fondo.

El ciclo umbral es inversamente proporcional a la cantidad de ARN objetivo en la muestra inicial: cuanto menor sea el ciclo umbral, mayor será la cantidad de ARN de interés.

La cuantificación absoluta compara el ciclo umbral o la intensidad de fluorescencia con la de una curva estándar preparada utilizando concentraciones de ADN conocidas.

Alternativamente, la cuantificación relativa compara la fluorescencia de una muestra con la de una referencia. Este método se puede utilizar para comparar los cambios en la expresión génica en diferentes condiciones.

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