32.8: Principios de la cromatografía en columna

La técnica de cromatografía fue inventada por primera vez en 1901 por Michael S. Tswett, un botánico ruso, para separar pigmentos vegetales utilizando disolventes orgánicos. Además, en 1941, Archer John Porter Martin y R. L. M. Synge modificaron la técnica empaquetando gel de sílice en una columna. entonces se separó una mezcla de aminoácidos en la columna empaquetada usando una mezcla de cloroformo y agua como fase móvil. Este fue el primer informe sobre cromatografía en columna. En la actualidad, la cromatografía en columna es una técnica ampliamente utilizada para separar varios tipos de compuestos de una mezcla de muestra.

Factores que influyen en la separación eficiente de proteínas

Varios parámetros, como el material de la columna, el empaquetamiento y las condiciones operativas, como los caudales y la temperatura, determinan la eficiencia de la separación mediante cromatografía en columna.

La elección del material de la columna o de la matriz determina el grado de interacción con la muestra. El material de la matriz debe estar apretado y uniformemente empaquetado en la columna. Las burbujas de aire, los desechos, las partículas grandes y los precipitados interfieren con el flujo uniforme del disolvente a través de la columna, afectando su eficacia de separación. La columna también debe estar libre de partículas.

La muestra inyectada en la columna debe ser clara y libre de agregados que puedan obstruir la columna y dificultar el flujo de disolvente. El caudal de disolvente también afecta la separación. Los caudales de disolventes muy altos o muy bajos dan como resultado una separación ineficiente de compuestos y preparaciones impuras. Velocidades muy altas también pueden alterar el empaque de la columna, afectando la eficiencia del proceso. Además, la composición del tampón de elución también es un factor importante. Debe ser no corrosivo y compatible con la muestra y también con el material de la columna para evitar la precipitación o disolución in situ.

Otro parámetro operativo, la temperatura, también juega un papel importante en el proceso. Decide la estabilidad de la muestra, el material de la columna y el tampón disolvente. Además, una temperatura constante en toda la columna resuelve los compuestos de manera eficiente. Después de completar el proceso de separación, las columnas se deben lavar minuciosamente pasando repetidamente un disolvente adecuado para evitar la contaminación de la muestra en análisis posteriores. Ocasionalmente, el disolvente se pasa por una columna en dirección inversa para eliminar cualquier material obstruido.

Limitaciones

Aunque es una técnica muy utilizada, el método todavía tiene algunas limitaciones. Es un método que requiere mucho tiempo ya que los caudales deben ser más lentos para una mejor resolución de los compuestos. Además, las grandes cantidades de disolventes de alta pureza necesarios en la fase móvil encarecen el proceso. Esto también aumenta el costo de ampliación cuando se necesitan mayores rendimientos de compuestos puros.

La cromatografía en columna es una técnica bioquímica utilizada para separar compuestos en función de sus propiedades físicas y químicas.

Tiene dos componentes principales: la fase sólida estacionaria o la matriz y la fase móvil líquida o el solvente.

La columna empaquetada en matriz se carga con una muestra, como una mezcla de proteínas. A continuación, se utiliza el disolvente para transportar la muestra a través de la columna.

Dentro de la columna, la matriz actúa como una malla molecular que filtra las proteínas en función de su tamaño o interacción con la matriz. Las proteínas más grandes tienden a viajar más rápido que las proteínas más pequeñas, lo que resulta en una separación basada en el tamaño.

Además, las proteínas de una muestra pueden interactuar con la matriz. Las interacciones débiles permiten que las proteínas pasen rápidamente, mientras que las interacciones fuertes retienen las proteínas dentro de la columna.

Un cambio gradual en el pH o la fuerza iónica del solvente altera las interacciones de las proteínas con la matriz y ayuda a eluir las proteínas en fracciones separadas.