32.8: Principios de la cromatografía en columna

La técnica de cromatografía fue inventada por primera vez en 1901 por Michael S. Tswett, un botánico ruso, para separar los pigmentos de las plantas utilizando disolventes orgánicos. Además, en 1941, Archer John Porter Martin y R. L. M. Synge modificaron la técnica empaquetando gel de sílice en una columna. A continuación, se separó una mezcla de aminoácidos en la columna empaquetada utilizando una mezcla de cloroformo y agua como fase móvil. Este fue el primer informe sobre cromatografía en columna. En la actualidad, la cromatografía en columna es una técnica ampliamente utilizada para separar varios tipos de compuestos de una mezcla de muestra.

Factores que influyen en la separación eficiente de las proteínas

Varios parámetros, como el material de la columna, el empaquetamiento y las condiciones operativas, como los caudales y la temperatura, determinan la eficiencia de la separación por cromatografía en columna.

La elección del material de la columna o de la matriz determina el grado de interacción con la muestra. El material de la matriz debe estar compactado y uniformemente en la columna. Las burbujas de aire, los residuos, las partículas grandes y los precipitados interfieren con el flujo uniforme del solvente a través de la columna, lo que afecta su eficiencia de separación. La columna también debe estar libre de partículas.

La muestra inyectada en la columna debe ser clara y estar libre de agregados que puedan obstruir la columna y obstaculizar el flujo de solvente. El caudal de disolvente también afecta a la separación. Los caudales muy altos o muy bajos de disolventes dan como resultado una separación ineficiente de compuestos y preparaciones impuras. Las tasas muy altas también pueden perturbar el empaquetamiento de la columna, lo que afecta la eficiencia del proceso. Además, la composición del tampón de elución también es un factor importante. Debe ser no corrosivo y compatible con la muestra y también con el material de la columna para evitar la precipitación o disolución in situ.

Otro parámetro operativo, la temperatura, también juega un papel importante en el proceso. Decide la estabilidad de la muestra, el material de la columna y el tampón de disolvente. Además, una temperatura constante en toda la columna resuelve eficientemente los compuestos. Una vez finalizado el proceso de separación, las columnas deben lavarse a fondo pasando repetidamente un disolvente adecuado para evitar la contaminación de la muestra en tiradas posteriores. Ocasionalmente, el solvente se pasa en una columna en la dirección inversa para eliminar cualquier material obstruido.

Limitaciones

Aunque es una técnica muy utilizada, el método todavía tiene algunas limitaciones. Es un método que requiere mucho tiempo, ya que los caudales deben ser más lentos para una mejor resolución de los compuestos. Además, las grandes cantidades de disolventes de alta pureza necesarios en la fase móvil encarecen el proceso. Esto también aumenta el costo de aumento cuando se necesitan mayores rendimientos de compuestos puros.

La cromatografía en columna es una técnica bioquímica utilizada para separar compuestos en función de sus propiedades físicas y químicas.

Tiene dos componentes principales: la fase sólida estacionaria o la matriz y la fase móvil líquida o el solvente.

La columna empaquetada en matriz se carga con una muestra, como una mezcla de proteínas. A continuación, se utiliza el disolvente para transportar la muestra a través de la columna.

Dentro de la columna, la matriz actúa como una malla molecular que filtra las proteínas en función de su tamaño o interacción con la matriz. Las proteínas más grandes tienden a viajar más rápido que las proteínas más pequeñas, lo que resulta en una separación basada en el tamaño.

Además, las proteínas de una muestra pueden interactuar con la matriz. Las interacciones débiles permiten que las proteínas pasen rápidamente, mientras que las interacciones fuertes retienen las proteínas dentro de la columna.

Un cambio gradual en el pH o la fuerza iónica del solvente altera las interacciones de las proteínas con la matriz y ayuda a eluir las proteínas en fracciones separadas.