Vídeo de alta resolución de Seguimiento de la locomoción en adultos de Drosophila melanogaster

Resumen

El estudio del comportamiento complejo en el aparato locomotor Drosophila melanogaster Depende de la capacidad de cuantificar los cambios en el movimiento de una mosca dado. Este artículo muestra cómo hacer esto con un sistema de rastreo de alta resolución.

Resumen

Las moscas proporcionar un importante modelo para estudiar el comportamiento complejo debido a la gran cantidad de herramientas genéticas disponibles para los investigadores en este campo. Estudiar el comportamiento del aparato locomotor en

Protocolo

Parte 1: alimentación y manejo de las moscas

1. Las moscas deben ser cultivadas en frascos de levadura libre de los medios de comunicación estándar. Usted necesitará un gran número de moscas, por lo que cruza es necesario establecer en consecuencia. Las moscas deben ser cultivadas en un 12 horas de luz: oscuridad ciclo a 25 º C.
2. Las moscas deben ser recogidos poco después de la eclosión (1-3 días). Las moscas pueden ser trabajado en esta etapa con un difusor de dióxido de carbono, y deben ser ordenados en tubos de ensayo que contiene los medios de comunicación en autoclave o sin levadura. Utilizamos sólo los machos, almacena 10 a un tubo de ensayo.
3. Deje por lo menos un día o dos después de su uso de dióxido de carbono antes de ejecutar los experimentos de comportamiento. Se corre vuela en nuestro ensayo de comportamiento de 3-5 días después de la eclosión.
4. Los ensayos se debe hacer siempre en la misma ventana de tiempo de 2-3 horas cada día para evitar problemas de ritmo circadiano.

Parte 2: Configuración del sistema de seguimiento en un ambiente controlado

1. Todos los experimentos se hacen en una sala de medio ambiente que mantiene una temperatura constante de 25 º C con una humedad del 70%.
2. Suspender una cámara de vídeo digital sobre la zona a grabar (la cámara hacia abajo). Desde nuestro software de seguimiento basado en un contraste, se suspenderá la cámara a través de una caja de luz. La cámara graba vídeos directamente en un ordenador Dell a través de una conexión FireWire. Usamos una cámara de vídeo digital de Sharp, conectado a una computadora Dell con Windows MovieMaker (versión de Vista) para la adquisición de video.
3. Pulsos de aire será administrado en el presente Protocolo, por lo que una fuente de flujo de aire debe estar presente en la sala. Con mangueras de caucho, conecte la fuente de aire a un filtro de carbono para la filtración de aire.
4. El uso de más tubos de goma, conecte el otro lado del filtro de carbón a un erlenmeyer a través de un tapón de goma hueco, y llenar el recipiente con aproximadamente media pulgada de agua. Esto humedecer el aire.
5. El frasco debe también tener un arma, que se conectará a una válvula en forma de Y a través de un tubo de goma.
6. Una rama de la Y de la válvula debe estar conectado a un medidor de caudal. La otra rama que suministra aire a la cámara de locomoción cuadrados.

Parte 3: Entrega de las moscas a la cámara de locomoción

1. La cámara de locomoción cuadrados se basa en el diseño de Wolf et al. 2002 ^1, con la incorporación de bandejas de pequeña gota para evitar que las moscas que vuelan dentro de la cámara. La cámara debe ser desarmado, y todos los componentes deben ser cuidadosamente limpiados con etanol al 70% y se seca antes de su uso.
2. Anestesia inmediatamente antes de la realización de un ensayo de comportamiento que podría comprometer el rendimiento. Para evitar esto, las moscas se golpeó suavemente en la cámara usando un embudo con una pequeña salida. Para hacer una salida del tamaño adecuado, colocar un azul punta de la pipeta (para P1000) hasta el final de un embudo. Utilice unas tijeras para cortar el extremo de la punta de la pipeta para hacer la abertura lo suficientemente grande como para volar a pasar.
3. La parte superior de nuestra cámara es una pequeña pieza de plexiglás asegurada con tornillos en los bordes. Al retirar los tornillos, los agujeros pueden ser utilizados para presentar las moscas en la cámara. Coloque la parte superior de plexiglás, para que el agujero del tornillo se encuentra directamente sobre la cámara interior, en lugar de que un tornillo se encuentra normalmente. Tome un tubo de ensayo que contienen las moscas y colocarlo boca abajo sobre el embudo, el cual debe ser colocado en el agujero del tornillo.
4. NO SE DEBE mover el embudo, ya que esto podría perjudicar o dañar a las moscas. En cambio, suavemente golpe toda la cámara, un embudo y todos, hasta que todas las moscas dentro de la cámara. Este golpear se debe hacer en una alfombrilla de ratón para absorber el impacto de esta golpeando. Cuando las moscas están en el interior, retire el embudo, y volver a colocar la tapa de plexiglás sobre las camas de tornillo. A continuación, volver a atornillar la tapa de plexiglás en su lugar.

Parte 4: Al realizar el análisis Locomotor

1. Una vez que las moscas se han cargado correctamente, deje que se aclimate en la cámara durante 30 minutos. Este período de aclimatación debe tener lugar en el ambiente (25 º C, 70% de humedad), y la cámara debe ser colocado en la parte superior de la caja de luz (que debe estar encendido). Encienda las luces de sala de otros.
2. Tras el período de aclimatación, el parámetro-y de la válvula en el sistema de flujo de aire de tal manera que el aire sólo el flujo del medidor de caudal. A su vez en el aire, y la rampa de aire hasta la velocidad deseada (4.0-6.0 L / min). Por lo general, el uso 5.0-5.5 L / min, pero cualquier velocidad en ese rango de trabajo.
3. Una vez que la velocidad deseada se alcanza, el parámetro-y la válvula para que el aire fluye a la cámara de locomoción. Esta vez el aire de latidos durante 15 segundos, y luego, abruptamente, a su vez el flujo de aire. A medida que gira el aire apagado, conecte la cámara al modo de grabación. (Esta parte requiere de práctica para hacer todo a la vez).
4. Detener la grabación después de la hora deseada y guardarla. Registramos 30 en segunda a 10 cuadros por segundo (al menos 8 ensayos por genotipo).

Parte 5: Análisis de Videos

1. Usamos elImagen Sistema de Análisis Dinámico (DIAS) software 3.2 para el seguimiento del movimiento ^2. Para poder utilizar este software, lo primero que convertir nuestros videos a un formato de archivo AVI con QuickTime 7.5.5.
2. Para realizar el seguimiento de las moscas basado en el contraste, se utiliza el "Autotrace por Umbral" función. A continuación, utilizar el "Hacer trazado de Trace" función para digitalizar estas huellas.
3. Para dar salida a la velocidad instantánea de cada vuelo, se utiliza el "Cálculo de los parámetros de" la función de producir un archivo de base de datos (DIAS específicos). Con esta función, también sin problemas los datos mediante un "5,15,60,15,5" Tukey ventana suavizado.
4. Una vez que esta información es emitida como un archivo de base de datos, se puede abrir en Microsoft Excel. Nosotros usamos un script de Matlab para compilar la velocidad instantánea en Excel y calcular los parámetros adicionales necesarios para la comprensión de la dinámica del movimiento y la estructura de combate.

Los resultados representativos:

La figura 1 muestra las huellas representante de los organismos de tipo salvaje Cantón de S (Figura 1, panel izquierdo) y las moscas nulos para el gen dCASK que fueron generados por el cruce de dos grandes deleciones superpuestas (Df (3R) X307 y Df (3R) X313) (Figura 1 , panel derecho). moscas dCASK nulos han sido demostrado que tienen problemas del aparato locomotor utilizando paradigma de Buridán ^3, y en nuestro paradigma, en comparación con el Cantón de S, que muestran gran disminución de la locomoción. La humanidad siempre corre organismos de tipo salvaje primero para asegurarse de que las condiciones y el comportamiento están dentro del rango normal en un día determinado. Hemos observado desviaciones estándar de las respuestas en menos de 5% de los días de prueba. Estas diferencias en general se puede atribuir a problemas con los parámetros de nuestro entorno controlado.

Figura 1. DIAS generado por las huellas de ambos Cantón S moscas de tipo salvaje (arriba, izquierda) y la locomotora con deficiencia de Null dCASK moscas generadas por las supresiones superposición (arriba, derecha). Las huellas representan lo que se ve en los vídeos grabados. Ambos rastros imágenes contraindicaciones 8-10 moscas funcionar durante 30 segundos en el ensayo de seguimiento de vídeo después de un pulso de aire.

Figura 2. Moscas de tipo silvestre se realizaron en el ensayo del aparato locomotor (arriba) después de un pulso de aire (barras moradas) y sin un impulso de aire (azul). En todos los parámetros calculados por el programa de análisis, no hubo diferencias significativas entre las dos condiciones (determinado con dos colas prueba t de Student). Esto demuestra que después de un impulso de aire, las moscas de locomoción normal en nuestra configuración.

Discusión

En nuestra configuración, un impulso de aire moderadamente fuerte transitoriamente detiene el movimiento de volar. Cuando el pulso termina de aire, las moscas son liberados de este estado estacionario y moverse con normalidad, como se muestra en la figura 2. Debido a que este impulso de aire efectivamente se sincroniza la locomoción de la población, lo usamos para comenzar el juicio por lo que también podemos estudiar el inicio del movimiento después de un estímulo impulso sin precedentes. El ensayo puede, sin embargo, ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Cámara cuadrada	Herramienta	Taller de máquinas	N/A	Diseño de Wolf et al. 20021
Cámara digital	Cámara	Sharp	ViewcamZ VL-23
Flujómetro	Herramienta	Cole-Parmer	SY-32003-12
Caja de luz	Herramienta	DNASTAR	Seq-Easy
Filtro de carbón activado	Herramienta	Fisher Scientific	09-744-37
DIAS 3.2	Software	Soll technologies	N/A	www.solltechnologies.com