Aquí se demuestra la microinyección citoplasmática de Xenopus laevis Ovocitos con un sustrato de importación nuclear, así como la preparación de los ovocitos inyectados para la visualización por microscopía electrónica de corte fino.
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Artículo de método
Microinyección de oocitos de Xenopus laevis
En este artículo
Resumen
Resumen
Microinyección de oocitos de Xenopus laevis seguido por el corte fino de microscopía electrónica (EM) es un excelente sistema para estudiar el transporte nucleocytoplasmic. Debido a su gran núcleo de alta densidad y de los complejos de poro nuclear (CPN), el transporte nuclear puede verse fácilmente en el ovocito de Xenopus. Mucho conocimiento de los mecanismos de importación y exportación nuclear se ha ganado a través del uso de este sistema (revisado por Pante, 2006). Además, hemos utilizado la microinyección de ovocitos de Xenopus a diseccionar las vías de importación nuclear de varios virus que se replican en el núcleo principal.
Aquí se demuestra la microinyección citoplasmática de los ovocitos de Xenopus con un sustrato de importación nuclear. También muestran la preparación de los ovocitos inyectados para la visualización de corte fino EM, incluyendo la disección, la deshidratación, y la incorporación de los ovocitos en una resina epoxi incrustación. Por último, se ofrecen los resultados representativos de los ovocitos que se han microinyección con la cápside del nucleopoliedrovirus baculovirus Autographa californica (AcMNPV) o el virus del parvovirus Minuto de ratones (MVM), y discutir las posibles aplicaciones de la técnica.
Protocolo
Parte 1: Preparación de los ovocitos de Xenopus para la microinyección
- Coloque una pequeña porción (alrededor de 2 cm) de Xenopus ovario laevis en un tubo cónico de 50 ml que contienen 20 ml de solución de colagenasa (5 mg / ml de colagenasa en calcio sin modificar Barth salina: 88 mM de NaCl, 1 mM KCl, 0,82 mM MgSO 4, 10 mM Hepes, pH 7,5). Colagenasa se utiliza para eliminar las células del folículo que rodean a los ovocitos.
- Coloque el tubo en una plataforma de agitación y el rock con suavidad (a 100 rpm) durante una hora. Este tiempo varía con los diferentes lotes de la colagenasa. Así, después de una hora....
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Discusión
Microinyección de ovocitos de Xenopus combinado con finas corte EM es una herramienta muy eficaz para el estudio de transporte nucleocytoplasmic. Este sistema ha sido utilizado para asignar los distintos pasos de la importación a través de la APN, por ejemplo de interacción de un sustrato de importación nuclear con componentes estructurales de la APN, tales como los filamentos de citoplasma y una canasta nuclear (revisado por Pante, 2006). También se ha utilizado para estudiar la importación nuclear de la energ.......
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Agradecimientos
Damos las gracias a David Theilmann (Pacific Agri-Food Research Centre, Summerland, Columbia Británica) para la prestación del baculovirus AcMNPV y útil para el debate.
Este trabajo fue apoyado por becas de la Fundación Canadiense para la Innovación (CFI), los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (CIHR), el Michael Smith Fundación para la Investigación en Salud (MSFHR), y el de Ciencias Naturales e Ingeniería de Investigación de Canadá (NSERC) .
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Referencias
- Panté, N. Use of intact Xenopus oocytes in nucleocytoplasmic transport studies. Methods Mol. Biol. 322, 301-314 (2006).
- Panté, N., Kann, M. Nuclear pore complex is able to transport macromolecules with diameters of about 39 nm. Mol. Biol. Cell
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Reimpresiones y permisos
