Artículo de método

Channelrhodopsin2 estimulación mediada de los potenciales sinápticos en Drosophila Las uniones neuromusculares

DOI:

10.3791/1133

⸱

16 de marzo de 2009

 ,  , 
1Department of Biology, Brandeis

En este artículo

Resumen

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Este procedimiento utiliza una luz azul activa el canal de las algas y las células específicas de las herramientas de la expresión genética para evocar los potenciales sinápticos con pulsos de luz en la unión neuromuscular (UNM), en Drosophila Larvas. Esta técnica es un barato y fácil de usar alternativas a la estimulación de electrodos de aspiración para los estudios de la fisiología sináptica en laboratorios de investigación y enseñanza.

Protocolo

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Parte 1: cuidado de los animales y cruces genéticos

  1. Mantener la UAS-ChR2 y OK371-GAL4 líneas de mosca en botellas separadas con los medios de comunicación estándar de mosca 8.
  2. Recoger las vírgenes de las líneas de vuelo OK371-GAL4 y los hombres de UAS-ChR2 líneas.
  3. Poner a hombres y mujeres en un frasco que contiene los medios de comunicación estándar de mosca se mezcló con 1 mM de todo-trans retinal (ATR). ATR alimentos debe ser hecha por los primeros medios de fusión vuelo regular en el microondas durante ~ 1 minuto. Una vez fundido, dejar enfriar durante unos 30 segundos a un minuto y añadir 100 ml de 100 mM ATR en EtOH al 100% por cada 10 ml de los medios de volar. Viales lugar en el hielo, a continuación, almacenar en un lugar oscuro a 4 ° C.
  4. Vamos compañero de moscas y ponen sus huevos en un lugar oscuro a 22-25 º C.
  5. Espere de 3-4 días hasta el 3 de larvas son visibles, en ese momento, disponer de las moscas adultas.

Parte 2: configuración del Rig

  1. Adjunte cualquier pieza de 10x disección del ojo alcance (en nuestro caso, de Carl Zeiss, Inc., www.zeiss.com, Thornwood, NY), a la fuente de luz LED azul con disipador de calor (laboratorios de Thor, www.thorlabs.com, Newton, Nueva Jersey ). Adjuntar a base magnética con un mensaje y una pinza. Cubierta del disipador de calor con un escudo de una toma de tierra para reducir el ruido eléctrico generado por la fuente de luz.
  2. Un lugar magnético base con fuente de luz en la mesa de aire de la electrofisiología equipo.
  3. Conecte la fuente de luz para controlar el circuito y conectar el circuito de control de fuente de alimentación externa (Powerlab 30.04, ADInstruments, www.adinstruments.com, Colorado Springs, CO).
  4. Dar 1-5 pulsos V al circuito de control para activar la luz azul.
  5. Ajuste base magnética y fuente de luz hasta haz de luz azul se centra en el área a ser ocupada por la disección de las larvas.

Parte 3: Disección

  1. Coloque seis pines 0,1 mm de insectos en el suelo de un plato Sylgard a ambos lados.
  2. Eliminar un 3 º estadio las larvas de los medios de comunicación de alimentos y el lugar en cualquier plástico Petri plato.
  3. Enjuague las larvas con solución salina para eliminar la comida.
  4. Coloque las larvas en la disección plato cerca de las clavijas tiró y añadir solución salina a nivel medio.
  5. Orientar a las larvas de modo que usted puede ver dos tubos plateados (tráquea) que se ejecuta a lo largo de la superficie dorsal del animal.
  6. Inserte un alfiler directamente en la cola entre los tubos traqueales. Mantenga las larvas y coloque un alfiler segundo en su cabeza, asegurándose de estirar el cuerpo a lo largo.
  7. Haga una pequeña incisión cerca de la cola, y continuar hasta la longitud del cuerpo. Asegúrese de que las puntas de las tijeras son criados para no cortar accidentalmente nervios ventral y / o los músculos del cuerpo de la pared.
  8. Coloque los cuatro pernos en las cuatro esquinas de los animales ahora abdomen abierto. Los puso en el plato de disección con el fin de redondear los animales. Preparación pasador enseñado.
  9. El uso de pinzas y tijeras, quitar las tripas del animal, la tráquea y los cuerpos grasos.
  10. Enjuague la preparación con solución salina.
  11. Localice los lóbulos frontales (como se ve en la figura A) y el ganglio ventral de la preparación.
  12. Utilizando micro-tijeras, corte con cuidado a través del ganglio ventral justo detrás de los lóbulos frontales.

Parte 4: grabación de los músculos y la estimulación de luz azul

  1. Tirar de un electrodo 10-20 μω utilizando un extractor de electrodos electrónico (Sutter Instruments).
  2. Rellene el electrodo tiró con 3 M KCl.
  3. Lugar lleno de electrodos en el soporte del electrodo y la punta del electrodo maniobra con un micromanipulador cerca de preparación de las larvas bajo microscopio de disección en la electrofisiología equipo.
  4. Identificar los músculos 6 (M6) en cualquier segmento de la pared del cuerpo (figura A).
  5. Inserte con cuidado el electrodo en M6 y el reloj para hiperpolarización rápida. Potenciales músculo en reposo la membrana debe estar entre -30 mV a -70 mV.
  6. Ajuste la luz azul para que diseca preparación se centra en el haz de luz.
  7. Dar 20-100 pulsos de tensión ms al circuito de control. Incremental incremento de la tensión suministrada al circuito de control. Esté atento a potenciales de unión de excitación en la célula muscular (fig. 1B).

Los resultados representativos:

La figura 1A muestra un esquema del sistema de grabación y preparación de filetes. La figura 1B muestra EJP típica provocada por los pulsos de luz corta. Amplitud EJP muestra se resume la amplitud de dos neuronas motoras inervan conocida tanto por M6. Menor intensidad de la luz sólo se activa una unidad de motor (datos no mostrados).

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Figura 1: Un diagrama esquemático) General de un equipo de grabación intracelular y con LED azul. Cerebro (Br) se retira para inhibir la actividad rítmica en el ganglio ventral (VG). ChR2 se expresa en las neuronas motoras mediante el sistema GAL4-UAS. B) el registro intracelular de un músculo M6. 40 ms pulsos de luz azul (de 127 mW / mm 2) de forma fiable evocan grandes potenciales sinápticos (asteriscos) en M6.

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Discusión

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Los pasos críticos incluyen tanto la disección inicial y la entrada de las células musculares. Si los nervios se cortan o músculo dañado durante la disección inicial es difícil continuar con el resto del experimento. Durante la disección, se debe tener mucho cuidado con el ángulo de la disección de las tijeras hacia arriba tanto como sea posible durante la incisión dorsal. Durante el paso crucial en segundo lugar, entrar en una célula muscular, se debe vigilar a una hiperpolarización últimos ~ 30 mV. Valores por encima ...

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Divulgaciones

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No tenemos ningún conflicto de intereses a revelar.

Agradecimientos

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Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud subvenciones RO1GM MH-33205 y 067284-LC a Griffith y por una beca de la Universidad de Brandeis de investigación de verano para universitarios NJ Hornstein. Los experimentos preliminares de esta técnica se realizaron en el Laboratorio de Biología Marina, como parte de los 2.008 sistemas neurales y por supuesto el comportamiento de verano (NIMH subvención: R25 MH059472) en Woods Hole, MA.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
SylgardEllsworth Adhesivos4019862www.ellsworth.com
Minutens PinsFine Science Tools26002-10www.finescience.com
Plato de disecciónFisher Scientificwww.fishersci.com
Neuroprobe Intracell Amplifier and Head StageA-M Systems680100www.a-msystems.com
Sistema de adquisición de datos Powerlab 4/30figure-materials-1 ADInstrumentswww.adinstruments.com
Estimulador de céspedGrass Technologies www.grasstechnologies.com
Ordenador de sobremesaDellwww.dell.com
>Alcance de disecciónLeica Microsystemswww.leica-microsystems.com
Fuente de luzDolan-Jenner Industries41446-062www.dolan-jenner.com
Fly Media
All-Trans-RetinalSigma-Aldrich116-31-4www.sigmaaldrich.com
OK-371 Gal4 MoscasBloomington Stock center
UAS-ChR2 MoscasFiala lab, Griffith lab
Circuito de controlador LEDConstruido en Griffith labhttp://www.ledsupply.com
http:// www.futureelectronics.com
Compuesto por:
1. 200 mA Buck Puck
2. LED azul
3. Cable aislado
4. Placa de pan de circuito
LED Disipador de calorThorlabs Inc.http://www.thorlabs.com/
Air TableTMChttp://www.techmfg.com/products/accessories/intro3.html
Jaula de Faradayconstruida en el laboratorio
Leica Micromanipulador Leitz MLeica MicrosystemsACS01www.leica-microsystems.com
PortaelectrodosAxon Instrumentswww.axon.com
Vidrio de borosilicatoFHC, Inc.www.fh-co.com/p14-15.pdf
Extractor de electrodosSutter Instrument Co.www.sutter.com
HL 3.1 Solución salina con 0.8mM Ca2+Contenido (mM):
NaCl:70 KCl:5 CaCl2: 0.8
MgCl2:4Sacarosa:115
NaHCO3: 10 Trehalosa: 5
Herramientas de Micro-DisecciónHerramientas de Ciencia Finawww.finescience.com
Griffith HEPES

Referencias

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  1. Keshishian, H., Broadie, K., Chiba, A., Bate, M. The Drosophila neuromuscular junction: a model system for studying synaptic development and function. Annu Rev Neurosci. 19, 545(1996).
  2. Collins, C. A., DiAntonio, A. Synaptic development: insights from Drosophila. Curr Opin Neurobiol. 17 (1), 35(2007).
  3. Lagow, R. D., et al. Modification of a hydrophobic layer by a point mutation in syntaxin 1A regulates the rate of synaptic vesicle fusion. PLoS Biol. 5 (4), e72(2007).
  4. Nagel, G., et al. Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses. Curr Biol. 15 (24), 2279(2005).
  5. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 13940(2003).
  6. Schroll, C., et al. Light-induced activation of distinct modulatory neurons triggers appetitive or aversive learning in Drosophila larvae. Curr Biol. 16 (17), 1741(2006).
  7. Lin, D. M., Auld, V. J., Goodman, C. S. Targeted neuronal cell ablation in the Drosophila embryo: pathfinding by follower growth cones in the absence of pioneers. Neuron. 14 (4), 707(1995).
  8. Ralph Greenspan, Fly Pushing: The Theory and Practice of Drosophila Genetics, 2nd ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2004).

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Etiquetas

Drosophila Neuromuscular JunctionGAL4 UAS SystemBlue Light StimulationElectrophysiology RigMuscle RecordingLarval DissectionExcitatory Junctional PotentialAll Trans Retinol

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