Visualizar el vivo Drosophila Gliales-unión neuromuscular con tintes fluorescentes

Resumen

Se describen las características estructurales de la sinapsis neuromuscular Glia-en una nueva preparación de tejidos de adentro hacia afuera de las larvas de mosca en directo con tintes fluorescentes con microscopía confocal. Hemos marcado terminales de las neuronas en vivo con anticuerpos fluorescentes primaria de HRP, y también se visualiza el espacio perisynaptic con dextranos fluorescentes.

Resumen

Nuestro proyecto identificó GFP etiquetados estructuras gliales en la mosca en desarrollo larval sinapsis neuromuscular. Para ver el desarrollo de vida de la glía sinapsis nervio-músculo, hemos desarrollado una preparación de tejidos larvarios que tenían características de las larvas intactas en vivo, sino que también tenía buenas propiedades ópticas. Esta nueva preparación también se permitió el acceso de perfusates a la sinapsis. Hemos utilizado larvas de mosca, inmerso en la hemolinfa artificial, y se relajó sus contracciones rítmicas normales del cuerpo por el frío ellos. A continuación se diseca los segmentos posteriores de cada animal y con un alfiler de insectos contundente empujó la partes de la boca hacia atrás a través de la cavidad del cuerpo. Esta eversión de la pared cuerpo de la larva, como convertir un calcetín del revés. Hemos completado la disección con tijeras de disección ultra-fino y por lo tanto expuesto el lado visceral de los músculos de la pared del cuerpo. Las estructuras gliales en la UNM expresa GFP membrana dirigidos bajo el control de promotores específicos gliales. La membrana post-sináptica, la República Socialista Soviética (Reticula subsináptica) en el músculo expresado sinápticamente objetivo dsRed. Necesitábamos etiqueta agudamente la terminales de las neuronas motoras, la tercera parte de la sinapsis. Para ello se aplicaron anticuerpos primarios a HRP, conjugado con una emisión flurophore rojo lejano. Para probar las propiedades de la difusión de color en el espacio perisynaptic entre los terminales de las neuronas motoras y la SSR, se aplicó una solución de grandes moléculas de dextrano conjugado con flurophore emitiendo ahora de color rojo y las imágenes recogidas.

Protocolo

Parte 1: Preparación del tejido

1. Nuestro objetivo es una preparación de tejidos de larvas de mosca en el sistema nervioso está intacto, pero la superficie interior de la pared muscular del cuerpo se expone a una hemolinfa artificial, y se pueden colocar cerca de un cubreobjetos microscopio para ópticas. En otras palabras, un interior a cabo la preparación de larvas.
   
   Dado que las preparaciones convencionales de tejidos se refieren al corte, fijación y estiramiento de la pared muscular del cuerpo, ya veces la eliminación de parte del sistema nervioso, necesitamos un enfoque diferente.
   
   Queríamos que los animales de dentro a fuera porq....

Discusión

Este procedimiento permite a largo plazo de imágenes en vivo de proteínas marcadas y los procesos celulares. La preparación en el tejido in situ que se describe tiene un sistema nervioso central intacto y funcionando, PNS y circuitos reflejos. Esta preparación de tejidos tiene ventajas sobre los protocolos estándar de larvas de mosca de los músculos, donde se estira el músculo de la pared del cuerpo larval (cuando se fija a cabo). El estiramiento puede distorsionar la morfología sináptica y desencadena.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
HL-6: Hemolinfa artificial de Drosophila, con 5 mM de L-glutamato añadido y 2 mM de calcio.	Reactivo	N/A	NA	El 5 mM de L-glutamato bloqueó las contracciones musculares. Utilizamos L-glutamato de grado molecular (Sigma). El 2 mM de calcio se aproxima a los niveles fisiológicos de calcio en la hemolinfa larvaria natural. Referencias: Macleod et al. 2002 y Macleod 2004
Dextrano, Alex Fluor 680; peso molecular de 10.000, aniónico, fijable	Reactivo	Molecular Probes, Life Technologies	D34680	Utilice una cámara de perfusión de pequeño volumen para mantener bajo el volumen total del colorante
Conjugado Anti-HRP-CY5 (de cabra)	Reactivo	Jackson ImmunoResearch	123-175-021	Diluya 2,0 mg en 1 ml de ddH2O; alícuotas de 4 microlitros. Congele a –20 °C. Diluya una alícuota en 100 microlitros de HL-6
Kit de etiquetado con anticuerpo Alexa 647	Reactivo	Molecular Probes, Life Technologies	A10475	Preparamos un total de 80 microlitros de anticuerpo primario conjugado y lo almacenamos en alícuotas de 2 microlitros. Diluimos cada alícuota en 100 microlitros de HL-6 para la marcación.
Aceite de inmersión formulado a medida, índice de refracción 1,3379	Reactivo	Cargill Labs	Formulado a medida
Pinzas ultrafinas	Herramienta	Fine Science Tools	11252-23 o 11295-20
Tijeras de resorte	Herramienta	Fine Science Tools	91500-09
Tijeras cortantes ultrafinas	Herramienta	Fine Science Tools	15200-00
Cámara de perfusión serie RC 20	Herramienta	Warner Instruments	64-02222
Confocal de disco giratorio	Microscopio	Quorum Technologies	Quorum Wave FX	Montado en un microscopio invertido Leica DMI6000