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Protocolo
Parte 1: Preparación para la microinyección
- Prepararse para la inyección tirando de agujas capilar mediante Sutter extractor aguja Instruments.
- Llene la aguja con un tinte fluorescente (como Texas-Red Dextran).
- Monte la aguja en un aparato de micromanipulador y microinyección.
- Corte la aguja del tamaño apropiado en un ángulo para crear una punta biselada.
- Mida el tamaño de la gota y comprobar que está entre 1-2NL por inyección de aceite.
Parte 2: Preparación de los embriones
- Inyectar a los embriones 30 minutos antes de la etapa de interés. Por ejemplo, para estudiar los ventrículos a las 24 horas posteriores a la fecundación (HPF), inyectar a los embriones en el 23,5 HPF. Etapa los embriones de acuerdo a Kimmel et al. (4).
- Bajo el microscopio estereoscópico, quite cuidadosamente el corion de los embriones con unas pinzas.
- El uso de un plato de plástico recubiertas con agarosa al 1%, perfore la agarosa con un plástico de 100 a 200 l punta de la pipeta. Con cuidado, retire los tapones de agarosa de los orificios con unas pinzas.
- La transferencia de los embriones en los medios de comunicación del embrión en el plato de agarosa con agujeros.
- Añadir tricaína (conforme a las Westerfield (5)) a los medios de comunicación para anestesiar a los embriones y evitar el movimiento durante el experimento.
- Con cuidado, coloque la cola del embrión hacia abajo en el hoyo, y orientarla de modo que el aparato de inyección está en el lado posterior del embrión.
Parte 3: La inyección del ventrículo cerebral
- Para inyectar el ventrículo cerebral, arreglar la configuración de micromanipulación de modo que la punta de la aguja está en el mismo campo de visión como el embrión de alta potencia.
- Con cuidado, colocar la aguja a través de la roofplate delgada de la parte posterior del cerebro justo detrás del hingepoint r0/r1 sin tocar el tejido cerebral a continuación.
- Inyectar medio de contraste suficiente para llenar por completo los ventrículos. Puede tomar varias inyecciones para rellenar el espacio del ventrículo izquierdo, dependiendo de la etapa del embrión.
Parte 4: Imágenes
- Con un paño limpio 1% de agarosa recubiertas plato, hacer agujeros nuevos en el plato, retire los tapones, y añadir tricaína para anestesiar a los embriones y evitar el movimiento.
- Coloque la cola del embrión ventrículo-se inyecta en el agujero y la posición de una imagen dorsal.
- Tomar una imagen con luz transmitida.
- Es muy importante para no mover el embrión o el microscopio.
- Cambie la configuración en el microscopio y tomar una imagen con luz fluorescente.
- Vuelva a colocar el embrión para tomar imágenes con los dos laterales de luz transmitida y luz fluorescente.
- Guarde las imágenes como archivos TIFF para el procesamiento de imágenes en Photoshop.
Parte 5: Procesamiento de Imágenes
- Para procesar las imágenes en Photoshop, abra la luz transmitida y fluorescencia imágenes de luz del mismo embrión adoptado en la misma posición. Asegúrese de que todas las opciones son las mismas para cada imagen.
- Arrastre su imagen fluorescente en la imagen de luz transmitida y alinearlos con exactitud.
- Con la imagen fluorescente, seleccione "Imagen", "Ajustes", y luego "Reemplazar color" y cambiar el fondo negro a blanco.
- En el "Reemplazar color" ventana de ajustar la "confusión" factor de la derecha hasta que las imágenes fluorescentes se ve de color uniforme.
- En la sección "Capas", seleccione "Multiplicar" para ver las imágenes superpuestas. La imagen de su espacio ventrículo debe coincidir con la imagen de luz transmitida con exactitud.
- Guarde este archivo y repita para otras imágenes.
Resultados representante / Resultados
Adecuada las imágenes de la inyección del ventrículo se muestran en la Figura 1 paneles de AD, mientras que un ejemplo de las imágenes de la inyección incorrecta se muestran en la EH. Inyecciones adecuadas tienen bordes afilados y el tinte no difuso. Inyección incorrecta, que se produce cuando se inserta la aguja demasiado lejos hacia el ventrículo y golpea el tejido cerebral a continuación, puede resultar en medio de contraste que es visible fuera del espacio ventricular y en la yema.
Figura 1. Ventrículo inyecciones de 25 embriones de tipo salvaje HPF. (AD) y el método de inyección correcta (EH) método de la inyección incorrecta se muestran como ejemplos. (A, E) imágenes de campo claro dorsal con sus correspondientes imágenes fluorescentes (B, F) y la superposición de las imágenes de fluorescencia y campo claro (C, G) para los métodos de inyección correctas e incorrectas se muestran. Las flechas indican las regiones donde colorante ha ido más allá del espacio ventricular cerebral debido a una inyección del ventrículo incorrecta (consulte la sección "Solución de problemas"). Anterior está a la izquierda en todas las imágenes.
Solución de problemas:
| Problema | Remedio |
| Usted está aplastando el embrión con la aguja. | Su aguja es demasiado contundente, o la punta es demasiado grande. | Comience con una aguja nueva y no se rompen tan lejos. El bisel de la aguja para que sea fuerte como una aguja de la jeringa. |
| El medio de contraste es en todo el embrión y la yema (Fig. 1E-H). | La aguja fue a través del tejido y no permanecer en el espacio ventricular. | Su aspiración podría no ser lo suficientemente aguda, por lo que son incapaces de controlar la velocidad de la punción. |
| El medio de contraste es demasiado débil o no en el cerebro anterior. | Que no ha utilizado una presión lo suficientemente alta como para la inyección o la aguja no estaba lo suficientemente anterior para alcanzar el cerebro anterior, cuando se inyecta el medio de contraste. | Aumento de la presión de inyección o colocar su aguja un poco más anterior durante la inyección. Usted puede poner la aguja a través de la frontera del cerebro medio-hindbrain si se requiere más detalle en el cerebro anterior. También puede simplemente esperar un poco para el tinte de difundir aún más antes de exponer. |
| Las imágenes fluorescentes son oscuros alrededor de los bordes después de la sustitución del color en Photoshop. | Se olvidó de cambiar el "confusión" en la ventana de configuración de reemplazar color. | Mueva la "confusión" todo el camino a la derecha de la ventana de reemplazar color. |
| La aguja no se pinche la roofplate rombencéfalo. | La aguja no se corta correctamente. | Hacer una nueva aguja. Si usted está haciendo una gran cantidad de inyecciones puede que tenga varias agujas, ya que pueden conseguir aburrido. |
Causa