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Trasplante de lentes en el pez cebra y su aplicación en el análisis de mutantes de ojos

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DOI:

10.3791/1258

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1 de junio de 2009

 ,  , 
1The Second Teaching Hospital of Jilin University, 2Department of Ophthalmology, Harvard Medical School

En este artículo

Resumen

Lente del desarrollo implica interacciones con otros tejidos. Varios mutantes ojo de pez cebra se caracteriza por un tamaño anormalmente pequeño lente. Aquí se demuestra un experimento de trasplante de lentes para determinar si este fenotipo se debe a causas intrínsecas o interacciones defectuosas con los tejidos que rodean a la lente.

Resumen

La lente tiene un papel importante en el desarrollo de la copa óptica [1,2]. Utilizando el pez cebra como modelo, cuestiones relacionadas con el desarrollo del objetivo se puede abordar. El pez cebra es útil para estudios genéticos, debido a varias características ventajosas, como el tamaño pequeño, alta fecundidad, el ciclo de vida corto, y la facilidad de cuidado. El desarrollo de la lente se produce con rapidez en el pez cebra. Por 72 HPF, la lente de pez cebra es funcionalmente maduro [3]. La abundancia de recursos genéticos y moleculares están disponibles para apoyar la investigación en el pez cebra. Además, la similitud de los ojos de pez cebra a los de otros vertebrados, proporciona la base para su uso como un excelente modelo animal de los defectos humanos [4-7]. Varios mutantes del pez cebra presentan anormalidades del objetivo, incluyendo altos niveles de muerte celular, que en algunos casos conduce a una completa degeneración de los tejidos del cristalino [8].

Para determinar si las anomalías de lentes se deben a causas intrínsecas o defectuosa la interacción con los tejidos circundantes, el trasplante de una lente en un ojo mutante de tipo salvaje se lleva a cabo. El uso del fuego pulido agujas de metal, lentes de mutantes o de tipo salvaje son cuidadosamente disecados de los animales donantes, y se introducen en la máquina. Para distinguir los tejidos de tipo salvaje y mutante, una línea transgénica es utilizada como donante. Esta línea expresa de membrana buenas prácticas agrarias en todos los tejidos, incluyendo la lente. Esta técnica de trasplante es una herramienta esencial en los estudios de los mutantes de la lente de pez cebra.

Protocolo

Parte 1: Preparación de los embriones

En este protocolo, vamos a utilizar el símbolo jj xy para referirse a un pez cebra mutante objetivo hipotético.

  1. Cepas de pez cebra se mantienen en condiciones estándar de instalación de los peces a 28,5 C en un ciclo de 14h light/10h oscuro.
  2. Por la noche, los hombres y las mujeres el lugar del pez cebra cepa xy jj: AB / TU, tg (mGFP) en un tanque con un divisor para separar el uno del otro. La descendencia de este cruce se expresa el transgén GFP en todos los tejidos, y se utilizarán como donantes. Al mismo tiempo, utilizar el mismo procedimiento para establecer los cruces entre los no transgénicos animales de tipo salvaje. Dependiendo del propósito de este experimento, uno puede cruzar animales de tipo salvaje en el locus jj xy como donantes o los ejércitos.
  3. Una hora después se enciende la luz de la mañana, quitar los separadores que permiten a los peces a su compañero.
  4. Después de 15-30 minutos recolectar embriones de 100 x 15 mm placas de Petri, limpios, y el cambio del medio (agua de huevo).
  5. Mantener los embriones en una incubadora de 28,5 C hasta el momento deseado.
  6. Cuando esté listo para el trasplante, retire el corion manualmente con dos pares de pinzas afiladas, y se incuban los embriones en un 0,2% en EDTA libre de calcio ZFR durante 30 minutos.

Parte 2: Preparación de las agujas de disección

  1. El procedimiento de trasplante requiere dos tipos de agujas: una afilada, que se utiliza para cortar los tejidos que rodean el lente, quite el corion, y los embriones liberación de agarosa, y una aguja de punta roma para mover la lente de los donantes y la inserta en el host. Aquí le mostraremos cómo hacer que estas agujas.
  2. En primer lugar, la punta de una pipeta Pasteur se debe cortar con un cuchillo de diamante. A continuación, inserte un capilar de vidrio en la punta de una pipeta Pasteur a fin de que aproximadamente la mitad de su longitud está dentro de él. Esto hará que sea más fácil para inmovilizar el alambre de tungsteno por la fusión en el tarro en el siguiente paso.
  3. A continuación, inserte un alambre de tungsteno delgado en el extremo abierto del capilar. Fundir el vidrio sobre el alambre con un mechero de Bunsen. Con unas pinzas, se mantienen constantes al final de cristal con el alambre de metal retorcido, mientras que el otro extremo de la aguja con la mano. El vidrio debe suavizado en espiral alrededor del metal se agarre en su lugar.
  4. Si usted está haciendo una aguja punta roma, entonces este es el final del procedimiento. Para crear una aguja afilada, sujete el alambre de tungsteno sobre un mechero Bunsen durante 1-1,5 minutos, quemando el metal por lo que una punta muy fina se crea. Comprobar la calidad de la punta por microscropy.It es una buena idea para esterilizar las agujas, tanto en la llama durante unos segundos inmediatamente antes del trasplante.

Parte 3: Preparación de los reactivos

  1. Libre de calcio pez cebra Ringer (ZFR) Soluciones (116 mM NaCl, 2,9 mM KCl, 5 mM HEPES, pH 7,2)
  2. 0,2% en EDTA libre de calcio pez cebra Ringer Solutions (pH 7,2)
  3. Agarosa al 1,2% (bajo punto de fusión) en el calcio libre ZFR
  4. 0,2% de agarosa (bajo punto de fusión) en el calcio libre ZFR
  5. Medio de embriones (pH 7.0, contiene por litro: 10 ml solución Hanks # 1, 1 ml de solución de Hanks # 2, 10 ml de solución de Hanks # 4, 10 ml de solución de Hanks # 5, 0,35 g de bicarbonato sódico, 300 l de HCl 2 M, penicilina-estreptomicina 500.000 U) Como en el libro El pez cebra (Universidad de Oregon Press, 2000).
  6. Alambre de tungsteno, chapado en oro de diámetro, 0,1 mm, Alfa Aesar
  7. Tubo capilar, el diámetro de 1,0 mm, instrumentos de precisión Mundial

Parte 4: procedimiento de trasplante

  1. En un tubo de centrífuga de plástico, prepare un 1,2% de agarosa de bajo punto de fusión en el calcio libre ZFR precalentado a 40 º C en un baño de agua.
  2. En la etapa deseada (30 HPF, por ejemplo), ocupan los embriones en una pipeta Pasteur, poco a poco su expulsión en el tubo de centrífuga, y poco a poco su expulsión en el tubo de centrífuga y se incuba durante unos 5 segundos. Los donantes y los anfitriones deben ser incubados por separado.
  3. Con una pipeta, tomar a los embriones en agarosa al 1,2% de la centrífuga y colocarlos en dos filas paralelas de poliestireno de 100 mm en una placa de Petri, manteniendo los anfitriones y los donantes por separado. Pipeteando hacia fuera despacio y con cuidado, la mayoría de los embriones se encuentran en los lados de la agarosa. Usted tendrá que reorientar las que no se encuentran en esta posición con la aguja de punta roma para que el ojo está mirando hacia arriba antes de la agarosa solidifica.
  4. Espere a que el 1,2% de agarosa para consolidar, a continuación, superposición con bajo punto de fusión de una solución 0,2% de agarosa.
  5. Con la aguja afilada, eliminar cualquier agarosa alrededor de los ojos, y corte con cuidado la lente de la Hostia y embriones de donantes con pequeñas pinceladas. Asegúrese de cortar lo suficientemente cerca de la lente para no destruirlo, sino también por lo que no quita exceso de tejido del resto del ojo receptor.
  6. Una vez libre, lentes de flotar en el medio. Utilizando la aguja de punta roma, empuje con cuidado el donantelente justo por encima de la ubicación de donde la lente de acogida sería normalmente, y luego lo empuja hacia abajo en el ojo con la aguja de punta roma. La lente de acogida puede ser descartado.
  7. Deja embriones de donantes y de acogida en agarosa al 1,2% durante 30-60 minutos, y luego los libera de la agarosa utilizando la aguja, y transferirlos a una placa de 24 pozos con medio embrión. Cada embrión debe ocupar un bien por separado. Asegúrese de marcar los pozos correctamente de modo que es evidente que corresponde a cada huésped de los donantes.
  8. Se incuba a 28.5 C. El derivado del donante lente se puede distinguir de la lente de acogida en el lado no operado del mismo animal basado en la fluorescencia de GFP. Las secciones también se puede hacer para medir el tamaño del objetivo y para determinar si se distingue adecuadamente.

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Fig. Una imagen de bajo aumento de una aguja afilada utilizada para la lente de un trasplante. Un vaso capilar (B) se inserta en la pipeta Pasteur (A), y un fino alambre de tungsteno (C) se inserta en el extremo abierto del capilar. El vidrio a través del cable se suaviza con un mechero de Bunsen. Con unas pinzas, se mantienen constantes al final de cristal con el alambre de metal mientras gira el otro extremo de la pipeta Pasteur con la mano. El vidrio debe suavizado en espiral alrededor del metal, agarrándolo en su lugar.


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Fig. 2 Las puntas de los dos tipos de agujas que se usan para la lente de un trasplante.


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Fig. 3 embriones sometidos a trasplante de lentes en 30hpf. Se muestran un embrión donante (A, B), un ojo con lente acogida en trasplantados (C, D), y el lado del control del embrión de acogida (E, F). Cada ojo se muestra tanto en la luz transmitida y luz UV, como se indica. Las fotografías fueron tomadas a las 48 HPF. El Q01 [9] línea transgénica se utiliza en este experimento.

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Discusión

Varios pasos requieren una atención especial durante el trasplante de la lente.

  1. Afiladas agujas: Es mejor preparar varias agujas antes de la realización del objetivo del trasplante, y la punta de la aguja debe ser lo más fina posible. Una aguja más gruesa lágrima más tejido debido a su mayor diámetro, provocando una falla en el ojo para curar.
  2. La organización de los embriones: Justo antes de que el trasplante debe colocar los embriones manera que se acueste de costado. Cuando el posicionamiento, e...

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Agradecimientos

Este procedimiento sigue en gran medida la técnica de trasplante desarrolladas para peces de las cavernas por el laboratorio de Bill Jeffrey.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Alambre de tungsteno de 0,1 mm de diámetroA Johnson Matthey45086
Agarosa (punto de fusión bajo)Sigma-Aldrich39346
Capilares de vidrio borosilicatadoWorld Precision Instruments, Inc.TW 100-4
PinzasDumont11252-30
Pipeta de PasteurFisher Scientific13-678-20C
Bomba para pipetaFisher Scientific13-683C
Placa de PetriCardinal HealthD1906
Penicilina-estreptomicinaGIBCO, by Life Technologies15140-122

Referencias

  1. Thut, C. J., Rountree, R. B., Hwa, M., Kingsley, D. M. A large-scale in situ screen provides molecular evidence for the induction of eye anterior segment structures by the developing lens. Dev Biol. 231, 63-76 (2001).
  2. Yamamoto, Y., Jeffery, W. R. Central role for the lens in cave fish eye degeneration. Science. 289, 631-633 (2000).
  3. Easter, S. S., Nicola, G. N. The development of vision in the zebrafish(Danio rerio). Dev Biol. 180, 646-663 (1996).
  4. Schmitt, E., Dowling, J. Early eye morphogenesis in the zebrafish. Brachydanio rerio. J.comp. Neuro. 344 (4), 532-542 (1994).
  5. Malicki, J. Harnessing the power of forward genetics--analysis of neuronal diversity and patterning in the zebrafish retina. Trends Neurosci. 23 (11), 531-541 (2000).
  6. Malicki, J., Pujic, Z., Thisse, C., Thisse, B., Wei, X. Forward and reverse genetic approaches to the analysis of eye development in zebrafish. Vision Res. 42 (4), 527-533 (2002).
  7. Avanesov, A., Malicki, J. Approaches to study neurogenesis in the zebrafish retina. Methods Cell Biol. 76, 333-384 (2004).
  8. Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. Zebrafish mutagenesis yields eye morphological mutants with retinal and lens defects. Vision Res. 42, 535-540 (2002).
  9. Godinho, L., Mumm, J. S., Williams, P. R., Schroeter, E. H., Koerber, A., Park, S. W., Leach, S. D., Wong, R. O. Targeting of amacrine cell neurites to appropriate synaptic laminae in the developing zebrafish retina. Development. Nov 132, 5069-5079 (2005).

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