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Para trabajar en condiciones estériles, se recomienda llevar a cabo todos los pasos en una campana de flujo laminar.
1. Materiales
- HEPES buffer: 10 mM HEPES-NaOH pH 7,4, NaCl 150 mM, KCl 5 mM, 1 mM MgCl 2, 1,8 mM CaCl 2)
- Colagenasa D solución: colagenasa D: 100 mg / mL (colagenasa D> 0,15 U / mg), en tampón HEPES
- DNasa I solución: 20.000 U / ml DNasa I
- Tampón PBS a pH 7,2
- PEB búfer: 1 parte de solución de archivo de BSA en 20 partes autoMACS solución de lavado
- Tejidos: pulmón derivado de niño de 6 / 7 semanas adulto hembra Balb / c ratón, libre de los órganos adyacentes.
- Opcional: MicroBeads CD11c, MACS columnas MS, Separador MACS para el aislamiento de células dendríticas del pulmón de ratón de un solo de células en suspensión
2. Disociar el tejido pulmonar
- Enjuague el tejido en una placa de Petri que contiene PBS para eliminar los eritrocitos.
- La transferencia de un máximo de 450 mg de tejido pulmonar a un tubo que contiene 4,9 gentleMACS C ml de tampón HEPES.
- Añadir 100 l colagenasa solución D a una concentración final de 2 D. mg / ml de colagenasa
- Añadir 10 l DNasa solución que hasta los tejidos de 150 mg (concentración final de 40 U / ml DNasa I) o 20 l de DNasa I de 150-450 mg tejido pulmonar (concentración final de 80 I U / ml DNasa).
- Cierre bien el tubo C y adjuntarlo a la gentleMACS disociador. A continuación, ejecute el programa "m_lung_01".
- Incubar durante 30 min a 37 ° C con rotación automática o manualmente girando cada 5 minutos.
- De retorno de muestras a la disociador gentleMACS y ejecutar el programa "m_lung_02".
3. Filtración
- Preparar un tubo de 50 mL para la recolección de células filtrada mediante la sustitución de la tapa con un colador de malla celular 70 micras.
- Una vez que el segundo Programa de gentleMACS extremos, dependiendo de la distribución de material de la muestra en el tubo, puede centrifugar el tubo brevemente para recoger el material de la muestra en la parte inferior del tubo.
- Eliminar las células a través de la tapa del tabique sellado del tubo C con una punta de la pipeta adecuada 1000 l, y aplicarlos a las células colador.
- Lave el filtro celular con 5 ml de tampón HEPES a temperatura ambiente.
- Centrifugar las células a un sedimento en un tubo de 50 ml en 300xg durante 10 minutos.
- Aspirar el sobrenadante y resuspender el botón celular en el volumen deseado de tampón PEB.
Parte 4: Resultados del representante:
Figura 1. Pulmón disociación con el disociador gentleMACS ™ resultó en 92% las células viables. Las células muertas se tiñeron con fluorescencia con yoduro de propidio (PI) (diagrama de puntos derecho, diagrama de puntos a la izquierda: no tinción PI).
Figura 2. Disociación de tejido pulmonar de ratón utilizando los resultados disociador gentleMACS en un alto porcentaje de leucocitos viables y células endoteliales. La derivada de una sola célula suspensiones fueron teñidas con CD45 y CD146-PE-FITC o CD31-FITC y analizadas por citometría de flujo.
Figura 3. Unicelulares suspensión derivadas de tejido pulmonar de ratón estaba manchada con CD11c-FITC y anti-mPDCA-1-APC para detectar ratón CD11c baja m-PDCA-1 + DCs plasmocitoide y células CD11c alta.
Figura 4. Enriquecimiento de las células dendríticas con MicroBeads CD11c, un separador de MiniMACS y dos columnas de la EM.