La preparación de bloques de células a partir de muestras de citología con predominio de células aisladas individualmente

Introducción:

Este es un video que describe el método para la preparación Shidham bloque de celdas de la citología de base líquida (LBC) muestra usando HistoGelTM (Thermo Scientific) (HG). En comparación con otros métodos de azar, las siguientes son las dos características fundamentales de este protocolo para la preparación de los bloques de celdas a partir de muestras relativamente hipocelular con células dispersas por separado perder (1-5).

1. Este protocolo incluye medidas para concentrar las células a lo largo del plano paralelo a la superficie de corte del bloque de celdas.
2. También incluye una inclusión faro como oscuro de AV-marcador (Figura 1b), que sirve a dos de los siguientes propósitos:
   1. Para visualizar el nivel en el que las células se concentran. El área del bloque de celdas con las células de su interés, puede ser visualizado por el histotecnólogo cuando la baliza de color oscuro se expone durante el corte. Esta capacidad de controlar contraseña para evitar el corte a través del nivel de la mayoría de las células, o de no cortar demasiado superficial en el nivel con mayor concentración de células de la muestra.
   2. Para servir como punto de referencia de localización en la sección de serie bloque de celdas en diferentes diapositivas. Este punto de referencia actúa como un faro para ayudar a localizar las células o grupos de células para la evaluación de un patrón de inmunorreactividad de coordinar con el enfoque de SCIP (6,7).

PROTOCOLO (Figura 2)

Preparación de la muestra.

1. Transferir el residuo LBC muestra de citología cervical a un tubo de vidrio plano inferior (15 mm de diámetro x 45 mm) (Figura 2.1 a 2.4). Coloque el tubo de vidrio en un tubo de plástico compañía más grande (28 x 85 mm) y se centrifuga. Retire el tubo de fondo de cristal del tubo portador y se vierte el sobrenadante.
2. El tubo de vidrio es el máximo (para evitar el derrame de agua de calefacción en el paso siguiente) y se coloca de nuevo dentro de un tubo grande de plástico de fondo plano portador
3. El tubo de plástico vehículo que contiene el tubo de vidrio es el máximo, coloca en una centrifugadora (con tazas giratorias y no tazas de ángulo fijo para que las células caen perpendicularmente a la parte inferior plana del tubo de vidrio), y se centrifugaron a 1.805 G (3000 rpm, rotor de radio-17cm) durante cinco minutos (Figura 2.5).
4. Los tubos se retiran de la centrífuga vertical y el tubo de cristal más pequeñas se retira con una pinza del tubo de plástico más grandes sin perturbar el precipitado sedimentado con las células.
5. El tubo de vidrio con la muestra es sin límite y el sobrenadante se vierte con cuidado de no perturbar la capa plana de células de sedimentos en la parte inferior (Figura 2.6).

La inclusión de la referencia de coordenadas AV-marcador y la adición de gel

1. Un faro oscuro AV-marcador (alrededor de 2 mm x 2 mm de tamaño, superficie plana, fragmento de material de color oscuro, sectionable) (Figura 3) se agrega como una señal para el tubo de vidrio (Figura 2.7).
2. Licuar una parte alícuota de HG por fusión en horno de microondas por 10 segundos a media potencia.
3. Añadir 0,5 ml de HG fundido en el tubo, se mezcla con los sedimentos con rapidez, y resumen (Figura 2.8) (Vaya al siguiente paso rápido sin permitir que el HG para comenzar a solidificar).
4. Añadir aproximadamente 2,5 ml de agua tibia (45 ° C) de agua al tubo de plástico portadora (Figura 2.9).
5. El tubo más pequeño de vidrio cubiertas se coloca dentro del tubo de plástico con agua tibia. (Este paso es necesario para mantener el HG se solidifique durante los próximos pasos) (Figura 2.9).
6. El tubo de plástico portadora se coloca en la centrífuga (con tazas giratorias y no tazas de ángulo fijo para que las células caen perpendicularmente a la parte inferior plana del tubo de vidrio), y se centrifugaron a 1.805 G (3000 rpm, radio-17cm rotor) durante cinco minutos. El propósito de esta etapa de centrifugación es empujar el marcador AV-y para concentrar las células en una capa más cercana a la superficie de corte del bloque de celdas de parafina último incorporado (Figura 1d).
7. Los tubos se retira con suavidad y vertical de la centrífuga cuidando de no alterar la capa de sedimento fino con las células de la muestra en la parte inferior.
8. El tubo de plástico más grande es no nivelado y el tubo de cristal más pequeñas se quita verticalmente con una pinza sin alterar la capa de sedimento de las células de la muestra.
9. El pequeño tubo de vidrio se refrigera en posición vertical durante 15 minutos para enfriar y solidificar el HG (Figura 2.11).

La eliminación del bloque de celdas como un botón de gel con muestras para su procesamiento final

1. El disco HG solidificado, con la capa de concentrado / sedimento muestra en el fondo se desprende de la parte inferior del tubo de vidrio plano por chorros de formol al 10% a través de una aguja de calibre 23 con la jeringa (Figura 2.12).
2. La aguja se introduce a lo largo del lado del tubo en la periferia del disco se solidificó con HG muestra (Figura 2.12).
3. El Needle se gira a lo largo del lado del tubo, mientras que la formalina es empujado lentamente a través de la jeringa. Esto resulta en la separación del botón junto con HG faro de color oscuro AV-marcador y la muestra se concentró en él desde el fondo plano del tubo de vidrio (Figura 2.12).
4. El bloque de celdas (botón de muestra de gel con las células) se coloca en una cinta de etiquetado y presentado para el procesamiento de tejidos embebidos en parafina para preparar los bloques de celdas (Figura 2.13).

Inclusión y corte de la muestra

1. El disco está incluido en parafina con el lado oscuro de radiobaliza hasta que la superficie de corte (Figura 1).
2. El bloque se secciona hasta que el color oscuro AV-marcador como un faro está expuesto y claramente visible.
3. De tres a cuatro secciones micras se cortan de este nivel que debe contener la mayor parte de las células individualmente dispersada por la muestra.
4. Las secciones se recogen en el portaobjetos para la tinción más, la tinción inmunohistoquímica, u otras pruebas, como se indica. Los protocolos para estos tests, incluyendo el tipo de diapositivas a utilizar para el montaje de las secciones puede variar. En general, para la inmunotinción, portaobjetos recubiertos se utilizan para evitar la pérdida de flotación y las secciones de las diapositivas durante las etapas de la inmunotinción.

Abreviaturas utilizadas (en orden alfabético): CISH, cromogénicos in-situ las pruebas de hibridación, el pescado, fluorescente in situ las pruebas de hibridación; FFPE, fijado en formol e incluido en parafina, FNA, aspiración con aguja fina; HG, HistoGel ™ (Thermo Scientific); LBC, la citología de base líquida, PCR reacción en cadena de la polimerasa;

Figura 1. La estructura del bloque de celdas preparadas por el protocolo de Shidham.

Figura 2. El resumen de los diferentes pasos para la preparación de bloque de celdas de muestra de LBC por el protocolo de Shidham.

Figura 3. Preparación de la AV-marcador de cáscaras de plátano.

Figura 4. Comparación de los bloques de celdas y secciones con y sin AV-marcador.

Figura 5. Comparación de la celularidad de las secciones del bloque de celdas con y sin AV-marcador.

Cell blocks are a valuable tool for evaluation of various cytology specimens (1). Most importantly, in addition to the architectural details of the specimen, cell blocks allow for evaluation of ancillary studies such as immunocytochemistry, fluorescent/chromogenic in-situ hybridization tests (FISH/CISH) and in-situ PCR. A variety of methods for preparation of cell block are described. However, most of these are suitable for non-gynecologic cytology specimens which contain relatively many cells and with tissue microfragments such as in FNA aspirates and some serous fluids such as effusions (1,3,4,5).

Because cell blocks primarily provide the opportunity for immunocytochemical evaluation, their processing should preferably be similar to that of the formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues. Ultimately the results obtained after immunocytochemical evaluation of cell block sections are compared to those with the published literature performed predominantly on FFPE tissue sections. Any alterations in the protocol potentially compromise and nullify the validity of the results obtained on cell blocks processed through different fixatives and reagent sequences other than that used for routine FFPE. Some commercial techniques may have the drawback of processing through a protocol of exposure to other fixative-reagent exposure.

Various methods of cell block preparation are available for specimens with a significant quantity of sediment and tissue fragments. Principally, the concentrated sediments are supported by some gel or coagulation principle. The maneuverable button is then embedded in paraffin after processing like the surgical pathology specimens/biopsies.

The gels used include gelatin, agar, fibrinogen/plasma-thrombin, and other commercial gels such as HG. The methods of concentration vary from simple pelleting of the sediment by centrifugation to concentration of cells along various types of membranes. Examples include: Milipore, collodin (Celloidin) bags or scraping the cells from the cytology smears on glass slides (1). We also evaluated a variety of gels by trying different combinations of agar and gelatin. None of the combinations achieved the a firm enough consistency to obtain an easily maneuverable disc of solidified gel with embedded cells from the specimen in one piece. HG showed appropriate consistency and in our experience the immunostaining results on HG cell block sections have been excellent.

Liquid based cytology (LBC) specimens for cervicovaginal cytology are generally less cellular than non-gynecologic specimens as mentioned above. In addition, the gynecologic LBC specimens predominantly contain individual scattered exfoliated superficial cells from cervicovaginal mucosa. Due to this, appropriate cellularity within the cell block sections may not be achieved without a special approach. As these singly scattered cellular components in the the block cannot be seen by the histotechnologist during section cutting, the level at which the cells start appearing in the sections cannot be appreciated and may be missed, either by cutting past the level with most cells or not cutting deep enough into the level with highest concentration of sample cells (Figure 4). Shidham’s protocol addresses both of these issues using HG as embedding medium and conventional lab equipments (2) (Figure 2).

This protocol involves following two major features (Figure 1):

1. Concentration and alignment of singly scattered cells in a narrow plane adjacent and parallel to the cutting surface of the cell block (Figure 5).
2. Inclusion of a beacon-like dark AV-marker as a signpost. This is critical for achieving following features:
   1. Identifying and monitoring the level at which the cells are concentrated in the cell block. The exposure of the dark colored signpost highlights the level at which most of the singly scattered cells in the cell block are expected to be located (Figure 4). This prevents the overcutting (cutting past the level with most cells) or undercutting (not cutting deep enough into the level with highest concentration of sample cells) in to the cell block and allow selection of the sections from the level in the cell block corresponding with highest concentration of cells.
   2. The dark colored signpost in the sections also serves as a reference point to survey and identify exactly the same cells in different serial sections of the cell block on different slides (Figure 4). This is critical while interpreting and evaluating the coordinate properties such immunoprofile of particular cells by the SCIP approach to follow the same cells in different sections (6,7).

Although our protocol is standardized and reported for liquid based cervical cytology specimens, it can also be used to enhance diagnostic yield of many other non-gynecologic specimens such as effusion fluids, FNA, brushings, cyst contents etc. In addition the AV marker would facilitate improved application of SCIP approach during immunohistochemical evaluation of cell block sections of these specimens. The embedding medium may be replaced by other reagents with appropriate modifications at relevant steps. HG may be replaced by plasma (Fibrinogen) to be gelled by Thrombin at room temperature (1).