Phosphoproteomics cuantitativo de ácidos grasos estimulada Saccharomyces cerevisiae</em

Resumen

Descripción de un procedimiento de fosforilación cuantitativos utilizando cryolysis, solubilziation urea, fraccionamiento HILIC y enriquecimiento IMAC de péptidos fosforilados.

Resumen

Este protocolo describe el crecimiento y la estimulación, con el oleato de ácidos grasos, de las células de Saccharomyces isótopos pesados ​​y ligeros S.. Las células son de tierra mediante un procedimiento cryolysis en un molinillo de molino de bolas y el grindate resultante llevó a la solución de solubilización urea. Este procedimiento permite la lisis de las células en un estado metabólicamente inactiva, la preservación de la fosforilación y la prevención de la reorientación de la phosphoproteome durante la lisis celular. Tras la reducción, alquilación, digestión con tripsina de las proteínas, las muestras se desala en las columnas C18 y la complejidad de la muestra reducida por fraccionamiento utilizando cromatografía de interacción hidrofílica (HILIC). Columnas HILIC preferentemente retener moléculas hidrofílicas, que es muy adecuado para phosphoproteomics. Péptidos fosforilados suelen eluir más adelante en el perfil cromatográfico de las contrapartes no fosforilada. Después de fraccionamiento, fosfopéptidos se enriquecen mediante cromatografía de inmovilizado de metal, que se basa en la base de carga para el enriquecimiento de fosfopéptidos afinidades. Al final de este procedimiento las muestras están listos para ser analizada cuantitativamente por espectrometría de masas.

Protocolo

Crecimiento de las células y los medios de comunicación

1. Una sola colonia de BY4742Δarg4Δlys1 células durante la noche en 100 ml de medio rico para un OD ₆₀₀ de 1,0 después de semillas en dos litros de una cultura medio levadura mínima (0,17% de levadura base de nitrógeno, sin sulfato de amonio o aminoácidos, 0,5% de sulfato de amonio) que contiene una complemento completo de aminoácidos, complementada con 20 mg / L de la arginina normal o isótopos pesados ^​​(13 C ₆ ¹⁵ N _4; Isotec) y lisina ⁽¹³ C ₆ ¹⁵ N _2; Isotec).
2. Las células fueron cultiva....

Discusión

Este método producirá un enriquecimiento de fosfopéptidos que puede ser analizada cuantitativamente. Una serie de parámetros pueden ser alterados en este protocolo, pero el aspecto más importante a recordar es el de preservar su fosforilación. Preparación de las células para la cuantificación se puede lograr de varias maneras diferentes, por ejemplo, si no se puede etiquetar las células in vivo, las etiquetas, como ICAT [3] o iTRAC [4] se puede utilizar después de la extracción de etiquetar diferencialmente dos.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Isotec™ L-Arginina-13C6,15N4	Sigma-Aldrich	608033
Isotec™ L-Lisina-15N2	Sigma-Aldrich	609021
GIBCO™ Solución salina tamponada con fosfato (PBS) 7,4 (10X) líquida	Invitrogen	70011044
Tabletas SigmaFAST de inhibidores de proteasa	Sigma-Aldrich	S8820
Cóctel de inhibidores de fosfatasas Pierce Halt	Thermo Fisher Scientific, Inc.	78420
Molinillo de bolas Retsch PM100	Retsch	20.540.0001
Frasco de molienda de acero inoxidable Retsch de 125 ml	Retsch	01.462.0148
Columna ultramicrospin C18	The Nest Group	SUM SS10
Sep-Pak Vac 500 mg C18	Waters	WAT043395
Columna analítica TSK-Gel Amide-80 de 4,6 mm x 25 cm	Tosoh Corp.	13071	Esta es la columna cromatográfica HILIC.
Columna de protección de 4,6 mm de diámetro interno x 1 cm	Tosoh Corp.	19021	Recomendamos esta columna de protección para prolongar la vida útil de su columna HILIC.
Gel de afinidad por hierro PHOS-Select™	Sigma-Aldrich	P9740	Esta es la resina IMAC. Aliquotar y almacenar.