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Artículo de método

Phosphoproteomics cuantitativo de ácidos grasos estimulada Saccharomyces cerevisiae

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DOI:

10.3791/1474

⸱

12 de octubre de 2009

 , 
1Institute for Systems Biology

En este artículo

Resumen

Descripción de un procedimiento de fosforilación cuantitativos utilizando cryolysis, solubilziation urea, fraccionamiento HILIC y enriquecimiento IMAC de péptidos fosforilados.

Resumen

Este protocolo describe el crecimiento y la estimulación, con el oleato de ácidos grasos, de las células de Saccharomyces isótopos pesados ​​y ligeros S.. Las células son de tierra mediante un procedimiento cryolysis en un molinillo de molino de bolas y el grindate resultante llevó a la solución de solubilización urea. Este procedimiento permite la lisis de las células en un estado metabólicamente inactiva, la preservación de la fosforilación y la prevención de la reorientación de la phosphoproteome durante la lisis celular. Tras la reducción, alquilación, digestión con tripsina de las proteínas, las muestras se desala en las columnas C18 y la complejidad de la muestra reducida por fraccionamiento utilizando cromatografía de interacción hidrofílica (HILIC). Columnas HILIC preferentemente retener moléculas hidrofílicas, que es muy adecuado para phosphoproteomics. Péptidos fosforilados suelen eluir más adelante en el perfil cromatográfico de las contrapartes no fosforilada. Después de fraccionamiento, fosfopéptidos se enriquecen mediante cromatografía de inmovilizado de metal, que se basa en la base de carga para el enriquecimiento de fosfopéptidos afinidades. Al final de este procedimiento las muestras están listos para ser analizada cuantitativamente por espectrometría de masas.

Protocolo

Crecimiento de las células y los medios de comunicación

  1. Una sola colonia de BY4742Δarg4Δlys1 células durante la noche en 100 ml de medio rico para un OD 600 de 1,0 después de semillas en dos litros de una cultura medio levadura mínima (0,17% de levadura base de nitrógeno, sin sulfato de amonio o aminoácidos, 0,5% de sulfato de amonio) que contiene una complemento completo de aminoácidos, complementada con 20 mg / L de la arginina normal o isótopos pesados ​​(13 C 6 15 N 4; Isotec) y lisina (13 C 6 15 N 2; Isotec).
  2. Las células fueron cultivadas durante 18 horas, a una OD 600 de 1,8. Es muy importante que las células pasan por lo menos 9 generaciones para lograr la plena incorporación de los isótopos marcados. La muestra de la luz se sedimentaron, se lava con agua estéril, resembrado en un medio que contiene oleato (isótopos normales arginina y la lisina, un 0,2% Oleato (Sigma Chemicals) y el 0,5% de Tween 40 (Sigma Chemicals)) y estimulada por otros 85 minutos. El resultado es un isotópicamente ligero, con respecto a la arginina y la lisina, oleato estimulada por la muestra y una isótopos pesados ​​de glucosa crecido muestra de referencia.

Lisis celular, aislamiento y fraccionamiento de los péptidos

  1. Pesar botella de centrífuga. Muestras de la cosecha por centrifugación durante 3 minutos. Eliminar los medios de comunicación y aspirar el exceso de líquido. Pesar de pellets y la botella (por lo general producirá entre 2.1 gramos) y luego congelar flash en nitrógeno líquido. Añadir un volumen equivalente al peso del pellet 'rectificado' buffer a los sedimentos congelados en nitrógeno líquido (tampón fosfato salino (PBS, Gibco), 10% de glicerol, inhibidores de la proteasa (SigmaFAST comprimidos inhibidor de la proteasa, Sigma) y inhibidores de la fosfatasa HALT (Thermo Scientific )).
  2. Congelar el recipiente de molienda en nitrógeno líquido. Espere hasta que el nitrógeno líquido deja hervir. La transferencia de la pastilla a la nave de molienda, con rodamientos de bolas congeladas.
  3. Molienda a 600 rpm con un 1 minuto 20 segundos con un ciclo de inversión de la dirección durante 3 minutos. Vuelva a congelar el recipiente de molienda en nitrógeno líquido. Repetir cuatro veces más de 15 minutos de tiempo total de molienda.
  4. Recoger el grindate congelado en un hielo de 50 ml Falcon tubo lugar seco. Almacenar a -80 ° C hasta su utilización.
  5. Prepare una solución de 10 ml de urea 8 M, bicarbonato de amonio 0,1 M, 0,1 M Tris pH 8,6. Añadir 3 volúmenes de tampón de urea a un volumen de la grindate congelados (por ejemplo 3mls del buffer de urea añade una pastilla de 1 gramo con 1 ml de tampón PBS). Inmediatamente sonicar la mezcla con un baño de ultrasonidos punta de la sonda (2 - 10 pulsos de segundo). Mantener la punta en la parte inferior del tubo para evitar la formación de espuma de la solución. El grindate debe ir inmediatamente a la solución.
  6. Borrar el lisado por centrifugación durante 5 minutos a 4 ° C.
  7. Transferir el sobrenadante a tubos nuevos.
  8. Hacer una alícuota de 0,5 M Tris [2-carboxietil] fosfina (TCEP). Añadir a la muestra a 1:100 para una concentración final de 5 mm. Se incuba a 37 ° C durante 1 h.
  9. Alquilación de cisteína reducidos. Dejar enfriar a temperatura ambiente. Hacer una parte alícuota de la yodoacetamida 1M. Mantener en la oscuridad (que envuelve el tubo en papel de aluminio). Añadir a una concentración final de 20 mM. Incubar en la oscuridad durante 1 hora a temperatura ambiente.
  10. Apagar la yodoacetamida con 20 mM DTT de una reserva de 1 millón a temperatura ambiente durante 1 h.
  11. Cuantificar la proteína de Bradford con un estándar o ensayo de BCA (no se describe). Tomar una muestra para su análisis por SDS-PAGE a continuación.
  12. Para validar la incorporación de los isótopos pesados, utilice 100 l de lisado reducida y alquilada. Diluir 1:4 con dH 2 O, ultrasonidos y añadir tripsina a 50:1 proteína a la tripsina. De digerir para un mínimo de 4 horas, muestra seca en un Speed ​​Vac y desalar luego con un Ultramicrospin columnas C18 (El Grupo de nido).
    1. Columna de hidratarse con 100 l de acetonitrilo
    2. Equilibre con 200 l TFA 0,1%.
    3. Resuspender la muestra seca en 200 l TFA 0,1%. De carga sobre la columna. Centrifugar a 200 xg ~ o de la velocidad mínima necesaria para el flujo a través de la columna.
    4. Lavar dos veces con 200 l TFA 0,1%.
    5. Eluir con dos veces con 50 l de acetonitrilo 60%, 0,1% de TFA.
    6. Muestra seca en un Speed ​​Vac.
    7. Resuspender la muestra en 20 l de ácido fórmico al 0,1%. Ejecutar 2 l de un espectrómetro de masas. Compruebe la incorporación de la arginina y la lisina isótopos pesados ​​por un turno de 10 y 8 Dalton en los respectivos m / z espectros. La incorporación de cada aminoácido debe estar entre 96 a 98%.
  13. Mezcle cantidades equivalentes (mg de proteínas) de las muestras de isótopos pesados ​​y ligeros.
  14. Diluir la muestra 1:4 con 20% de metanol.
  15. Añadir a la tripsina 1:200. Incubar toda la noche a 37 ° C.
  16. Compruebe que la digestión se ha ido hasta el final por SDS-PAGE. De ejecución 2 y 4 l de la muestra predigestión y un 8d 16 l de la digestión después de la tripsina. Visualizar por tinción Coomassie que la digestión es completa. Si no está completo, sonicar la muestra con un breve sonda sonicador punta y digerir de nuevo con tripsina.
  17. Secar la muestra en un Speed ​​Vac. Cuando se seca añadir 200 l de filtrado dH 2 O y agitar hasta que el precipitado se disuelve. Muestra seca en un Speed ​​Vac. Volver a suspender de nuevo con dH 2 O. Muestra seca de nuevo.
  18. Resuspender el pellet en 0,1% de ácido trifluoroacético (TFA, Sigma). Comprobar que el pH es de alrededor de 3 con tiras de pH. Si es necesario acidificar con 10% de TFA.
  19. Pellet cualquier precipitado.
  20. Desalinizar las muestras en una Waters Sep-Pak Vac 500 mg columna C18. No sobrecargue las columnas. La cantidad máxima es de 5 mg, pero es mejor para cargar un poco menos. Dividir la muestra entre varias columnas si es necesario.
    1. Hidratar la columna con 5 ml de acetonitrilo al 100%. Centrifugar a 200 xg ~ o de la velocidad mínima necesaria para el flujo a través de la columna.
    2. Equilibrar la columna con 5 ml de TFA 0,1%. Carga de la muestra. Recoge el flujo y la carga de nuevo.
    3. Lavar con 5 ml de TFA 0,1%. Repetir.
    4. Eluir con 2 ml de acetonitrilo al 60%, 0,1% de TFA.
    5. Muestra seca en un Speed ​​Vac.

Fraccionamiento de péptidos y aislamiento de fosfopéptidos

  1. Los péptidos son fraccionados en una columna HILIC. Utilizamos un TOSOH TSK-Gel Amida-80 4,6 mm x 25 cm columna analítica con una columna de seguridad. Tómese su tiempo con este paso, ejecute la columna durante 2 horas a 90% A continuación, ejecute dos gradientes en blanco antes de cargar la muestra. La carga máxima de una columna se considera que el tamaño en alrededor de XX, por lo general no se carga más de 5 mg por ciclo.
  2. Disolvente A - 98% ACN/0.1% TFA
    Disolvente B - 2% ACN/0.1% TFA
    De carga en un 90% más de 20 ', 90% A 85% A más de 5', un 85% al ​​60% más de 40 ', 60% A 0% A más de 5, 0% a un 90% más de una 5 '.
  3. El caudal es 1ml/min y las fracciones se recogieron a intervalos de 2 minutos a partir de el 85% a 60% A un gradiente.
  4. Combinar fracciones de reducir el número de fracciones a 10. El aumento de las fracciones es probable que el rendimiento mayor cobertura de la phosphoproteome.

Enriquecimiento de fosfopéptidos

  1. Fosfopéptidos se enriquecen con fosfato de hierro Seleccione gel de afinidad. Nos alícuota nuestra resina IMAC para evitar congelamiento repetido descongelación. Hacer 50 ml de ácido acético 250 mM, 30% de solución de carga de ACN. Llevar el pH a 2.7 con HCl. Volver a suspender las pastillas en 500 l de solución de carga. Verifique el pH, ajustar con HCl o NaOH según sea necesario.
  2. Prelavado 200 l de bolas de IMAC en una columna adecuada. Nosotros usamos las columnas Molbiotec giro.
    Añadir 15 l de una mezcla del 50% (gel para cargar la solución) a cada fracción, y se incuban las muestras durante 30 'con el extremo final sobre la rotación. Mantener el flujo para el análisis.
  3. Lavar las muestras 3 veces con solución de carga y una vez con 500 l filtrado dH 2 O.
  4. Péptidos eluir con 2 - 3 min con 400 l de 50 mM Na 2 HPO 4 (pH 8,4) de amortiguación. Transferir a un frasco de vidrio.
  5. Acidificar a pH 3 con ácido 5-l fórmico al 100%, la congelación de flash en nitrógeno líquido, y la muestra seca en un Speed ​​Vac.
  6. Fosfopéptidos Resuspender en 200 l de 0,1% de TFA y C18 limpia como se describe anteriormente. Secan las muestras eluidas en un Speed ​​Vac.
  7. Resuspender péptidos en 20 l de 0,1% de ácido fórmico. Use 2 l por el análisis de espectrometría de masas o como sea necesario.

Notas

Durante gran parte de este protocolo que va a trabajar "a ciegas". La lisis celular puede ser controlado por el Western Blot y ensayos de Bradford o BCA, y la digestión de la tripsina también se puede evaluar fácilmente. La columna HILIC se dio una huella similar a esta, o como se ve por otros [1, 2] en función de la máquina de cromatografía de líquidos que se utiliza. Las muestras son supervisados ​​por espectrometría de masas, las pruebas de las muestras en las máquinas de bajo costo, como LCQs o Maldis antes de ir a los análisis de costos de alta precisión en una gran masa, máquina de alta resolución. Por último, si un secado por una muestra con ácido en el mismo, el uso de cristal.

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Discusión

Este método producirá un enriquecimiento de fosfopéptidos que puede ser analizada cuantitativamente. Una serie de parámetros pueden ser alterados en este protocolo, pero el aspecto más importante a recordar es el de preservar su fosforilación. Preparación de las células para la cuantificación se puede lograr de varias maneras diferentes, por ejemplo, si no se puede etiquetar las células in vivo, las etiquetas, como ICAT [3] o iTRAC [4] se puede utilizar después de la extracción de etiquetar diferencialmente dos...

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Agradecimientos

Nos gustaría dar las gracias al Dr. Rich Rogers para la asistencia técnica con análisis de espectrometría de masas y sus útiles comentarios, y los Dres. Rob Moritz, Ranish Jeff, y Hamid Mirzai útil para los debates.

Este trabajo fue financiado por el NIH Centros de Excelencia.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Isotec™ L-Arginina-13C6,15N4Sigma-Aldrich608033
Isotec™ L-Lisina-15N2Sigma-Aldrich609021
GIBCO™ Solución salina tamponada con fosfato (PBS) 7,4 (10X) líquidaInvitrogen70011044
Tabletas SigmaFAST de inhibidores de proteasaSigma-AldrichS8820
Cóctel de inhibidores de fosfatasas Pierce HaltThermo Fisher Scientific, Inc.78420
Molinillo de bolas Retsch PM100Retsch20.540.0001
Frasco de molienda de acero inoxidable Retsch de 125 mlRetsch01.462.0148
Columna ultramicrospin C18The Nest GroupSUM SS10
Sep-Pak Vac 500 mg C18WatersWAT043395
Columna analítica TSK-Gel Amide-80 de 4,6 mm x 25 cmTosoh Corp.13071Esta es la columna cromatográfica HILIC.
Columna de protección de 4,6 mm de diámetro interno x 1 cmTosoh Corp.19021Recomendamos esta columna de protección para prolongar la vida útil de su columna HILIC.
Gel de afinidad por hierro PHOS-Select™Sigma-AldrichP9740Esta es la resina IMAC. Aliquotar y almacenar.

Referencias

  1. Albuquerque, C. P. A multidimensional chromatography technology for in-depth phosphoproteome analysis. Mol Cell Proteomics. 7 (7), 1389-1396 (2008).
  2. McNulty, D. E., Annan, R. S. Hydrophilic interaction chromatography reduces the complexity of the phosphoproteome and improves global phosphopeptide isolation and detection. Mol Cell Proteomics. 7 (5), 971-980 (2008).
  3. Gygi, S. P. Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. Nat Biotechnol. 17 (10), 994-999 (1999).
  4. Ross, P. L. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).
  5. Gruhler, A. Quantitative phosphoproteomics applied to the yeast pheromone signaling pathway. Mol Cell Proteomics. 4 (3), 310-327 (2005).
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  7. Villen, J., Gygi, S. P. The SCX/IMAC enrichment approach for global phosphorylation analysis by mass spectrometry. Nat Protoc. 3 (10), 1630-1638 (2008).
  8. Jensen, S. S., Larsen, M. R. Evaluation of the impact of some experimental procedures on different phosphopeptide enrichment techniques. Rapid Commun Mass Spectrom. 21 (22), 3635-3645 (2007).
  9. Larsen, M. R. Highly selective enrichment of phosphorylated peptides from peptide mixtures using titanium dioxide microcolumns. Mol Cell Proteomics. 4 (7), 873-886 (2005).
  10. Pinkse, M. W. Selective isolation at the femtomole level of phosphopeptides from proteolytic digests using 2D-NanoLC-ESI-MS/MS and titanium oxide precolumns. Anal Chem. 76 (14), 3935-3943 (2004).
  11. Tao, W. A. Quantitative phosphoproteome analysis using a dendrimer conjugation chemistry and tandem mass spectrometry. Nat Methods. 2 (8), 591-598 (2005).
  12. Zhou, H., Watts, J. D., Aebersold, R. A systematic approach to the analysis of protein phosphorylation. Nat Biotechnol. 19 (4), 375-378 (2001).
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