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Visualizar solo los complejos moleculares En Vivo Uso de microscopía de fluorescencia avanzada

DOI:

10.3791/1508

September 8th, 2009

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Summary

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Aquí nos demuestran los protocolos para la realización de una sola molécula de microscopía de fluorescencia en células vivas de las bacterias para permitir funcionales complejos moleculares para detectar, seguir y cuantificar.

Abstract

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Una visión completa de los mecanismos de las células vivas sólo puede lograrse mediante la investigación de los procesos clave que provocan y dirigir los eventos a nivel celular. Hasta la fecha, la complejidad de corte de los sistemas biológicos ha provocado precisa una sola molécula de la experimentación a ser demasiado exigente, en lugar de centrarse en los estudios de sistemas de un solo uso a granel relativamente crudo media del conjunto de mediciones. Sin embargo, muchos procesos importantes ocurren en la célula viva en el ámbito de una o unas pocas moléculas, las mediciones del conjunto en general, la máscara de la naturaleza estocástica y heterogéneo de estos eventos. En este caso, mediante microscopía óptica avanzada y herramientas de análisis de análisis de imagen que se muestra cómo controlar las proteínas dentro de una sola célula viva bacteriana con una precisión de las moléculas individuales y cómo podemos observar la dinámica dentro de los complejos moleculares en el funcionamiento de máquinas biológicas. Las técnicas son directamente relevantes fisiológicamente. Son mínimamente perturbativa y no invasiva a la muestra biológica objeto de estudio y están totalmente adaptados para las investigaciones en la materia viva, las características no disponibles para los otros enfoques de una sola molécula de la biofísica. Además, las muestras biológicas estudiadas todos los productos de proteína fluorescente con etiquetas en niveles que son casi idénticas a las cepas de células no modificadas ("codificación genómica"), en comparación con el enfoque más común pero menos ideal para generar mucha más proteína que se producen de forma natural ('plásmido de expresión "). Por lo tanto, las muestras biológicas reales que serán investigados son significativamente más cerca de los organismos naturales, y por lo tanto, las observaciones más relevantes para los procesos fisiológicos reales.

Protocol

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  1. Para iniciar este procedimiento, 50 l de material congelado de la proteína fluorescente expresando Escherichia coli células bacterianas primero se descongela y se cultiva aeróbicamente con agitación en 5 ml de medio de cultivo LB noche a 37 º C. Por la mañana, 50 l de esta cultura saturada se extrae y sub-cultivadas en un mínimo de M63 medios de glucosa en la cultura, la incubación a 30 º C durante 4 a 6 horas. Aquí se demuestra el uso de dos cepas diferentes de células, una de las cuales expresa un transporte de electrones del citocromo fusionado a GFP, y el otro que expresa una proteína implicada en el motor flagelar bacteriano fusionado a GFP.
  2. Células o bien pu....

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Discussion

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Se debe tener cuidado de no "sobre corte" de células para observar las bacterias atados, ya que esto puede perjudicar la funcionalidad de los motores del flagelo. Es importante la utilización de las células durante mucho más tiempo de una hora una vez en el portaobjetos del microscopio, ya que puede convertirse en falta de oxígeno. Optimización considerable puede ser requerido para encontrar las mejores condiciones de microscopio de imagen atiende a su sistema biológico específico bajo investigación. Puede ser.......

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Disclosures

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Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgements

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Reconocemos los donativos en especie de las cepas bacterianas de los grupos de la Prof. Judith Armitage (Universidad de Oxford, Reino Unido) y el Prof. Conrad Mullineaux (Universidad Queen Mary de Londres, Reino Unido). IMD es financiado conjuntamente por el Departamento de Bioquímica (Universidad de Oxford) y OCISB; AR es financiado por una Ingeniería y Ciencias Físicas Research Council (EPSRC) becas para estudios de DTC, ND se financia con la Biotecnología y Ciencias Biológicas de Investigación (BBSRC), MCL es financiado por una beca Real Sociedad de Investigación de la Universidad.

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References

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  1. Leake, M. C., Chandler, J. H., Wadhams, G. H., Bai, F., Berry, R. M., Armitage, J. P. Stoichiometry and turnover in single, functioning membrane protein complexes. Nature. 443, 355-358 (2006).
  2. Leake, M. C., Greene, N. P., Godun, R. M., Granjon, T., Buchanan, G., Chen, S., Berry, R. M., Palmer, T., Berks, B. C.

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Single Molecule FluorescenceAdvanced Fluorescence MicroscopyLiving Bacterial CellsFluorescent Protein TaggingTotal Internal Reflection FluorescenceElectron Multiplying CameraHigh Numerical Aperture ObjectiveFluorescent Spot DetectionPhoto Bleaching AnalysisMolecular Complex Visualization

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