Artículo de método

Preparación Extienda los cromosomas de las células estaminales embrionarias para cariotipo

DOI:

10.3791/1512

4 de septiembre de 2009

En este artículo

Resumen

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El cariotipo es una técnica sencilla y útil ampliamente utilizado para la detección de alteraciones genéticas. A continuación se describe paso a paso el protocolo para la preparación de los cromosomas propagación de células madre embrionarias humanas para controlar el estado cromosómico de estas células se mantienen en cultivo.

Resumen

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Aunque las células madre embrionarias (células madre) se ha demostrado que presentan un cariotipo diploide estable 1, muchos estudios han reportado que en función de las condiciones de cultivo se convierten propensos a adquirir las anomalías cromosómicas como la suma de la totalidad o partes de los cromosomas. De hecho, durante el cultivo prolongado, alteraciones del cariotipo se observan cuando la disociación enzimática o química se utilizan 2,3,4, mientras que la disección manual de las colonias de pases conserva un cariotipo estable 5. Además, los cambios en el medio ambiente tales como la eliminación de las células de alimentación también parecen poner en peligro la integridad genética de las células madre a 3,6. Una vez que las alteraciones cromosómicas pueden afectar la fisiología celular, la caracterización de la integridad genética de las células madre in vitro células madre es esencial considerar como una herramienta esencial en los estudios de la embriogénesis y la prueba de la droga. Por otra parte, para el futuro con fines terapéuticos cambios cromosómicos son una preocupación real, ya que se asocia frecuentemente a la carcinogénesis.

Aquí mostramos un método sencillo y útil para obtener alta calidad se extiende cromosoma para su posterior análisis del cromosoma establecidos por bandas G, FISH, SKY o técnicas de CGH 7,8. Se recomienda comprobar el estado cromosómico de rutina, con intervalos de 5 pasajes a fin de vigilar la aparición de las translocaciones y aneuploidías

Priscila Britto y Sartore Rafaela contribuido igualmente a la de papel.

Protocolo

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EQUIPO

  • De cultivo de tejidos incubadora a 37 º C, 5% de CO 2
  • Centrífugo
  • Juego de micropipetas (100, 100μL)
  • Baño de agua 37 ° C
  • Baño de agua a 90 ° C para ser fuente de vapor de agua
  • Microscopio de contraste de fase

PRIMER PASO

Tratar las células con colcemid

En este procedimiento se utilizó la línea de células madre cultivadas H9 en fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) inactivados con mitomicina C (Sigma) y se mantuvieron en DMEM/F12 (Invitrogen), complementado con el reemplazo de octavos de final 20% de su....

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Discusión

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La preparación de los diferenciales de los cromosomas es un paso crítico para el éxito de un análisis de la situación genética de las células madre embrionarias mediante técnicas de rutina como el G-bandas, y las técnicas más sofisticadas como el pescado, SKY y CGH.

Este procedimiento se puede aplicar a muchos tipos de células, variando el período de incubación colcemid, que depende de la duración del ciclo celular. Para las colonias de células madre embrionarias, que esperar 3 horas, mientr.......

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Tubo centrífugo de 15 mlTechno Plastic Products91015
Colcemid Karyo MAXGIBCO, by Life Technologies15212-012
EDTAIsofar721
Ácido acético glacialIsofar100
MetanolIsofar208
Cloruro de potasio (KCl)Merck & Co., Inc.104.931.000
PortaobjetosBioslide7105-1
TripsinaSigma-AldrichT4799

Referencias

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  1. Thomson, J. A. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1145 (1998).
  2. Draper, J. S. Recurrent gain of chromosomes 17q and 12 in cultured human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 22 (1), 53-53 (2004).
  3. M....

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