Una novela RFP reportero para ayudar en la visualización del disco imaginal del ojo en Drosophila</em

Resumen

Se describe una nueva proteína fluorescente roja (RFP) periodista que se expresa específicamente en el Drosophila Ojo. Se detalla una metodología para la disección del disco imaginal del ojo y cómo este indicador puede ser utilizado para ayudar en la disección y la identificación de tipos específicos de células en el ojo en desarrollo.

Protocolo

1. En primer lugar una gota de PBS en un plato Sylgard bajo un microscopio de disección.
2. A continuación, retire varias larvas errantes estadio tercero de un frasco o una botella con una espátula y colocarlos en la PBS.
3. Para comenzar la disección usar pinzas mano izquierda (si eres diestro) para captar una larva de dos tercios del camino hacia la parte posterior y luego usar el otro par para mantener los ganchos de la boca de color oscuro en el extremo anterior.
4. Ahora, tire suavemente de la larva, aparte de mover los dos pares de pinzas de distancia el uno del otro. El aparato bucal debe venir del resto del cuerpo con el complejo ojo / cerebro adjunto.
5. Para la tinción de los discos del ojo para corregir la inmunofluorescencia de los discos en este momento por su inclusión en el 4% de paraformaldehído / PBS solución durante 30-45 minutos en hielo. A continuación, lavar los discos de cuatro veces con PBST y luego con tinción de anticuerpos adecuados.
6. Es más fácil analizar los discos de los ojos directamente en una diapositiva. Coloque una gota de PBS en un portaobjetos y se mueven los discos a la caída de PBS mediante la celebración de las piezas bucales.
7. Los tejidos imaginal son translúcidas y así que al principio los discos de los ojos son difíciles de identificar. Para que sea más fácil identificar a utilizar un microscopio de disección con capacidad de fluorescencia. Con el ojo-RFP línea reportero de los discos del ojo se puede ver claramente como el tejido de color rojo fluorescente que cubre los lóbulos ópticos esféricos (Figura 1).
8. Si está utilizando una fibra óptica la fuente de luz fría dirigir la luz en un ángulo oblicuo a la diapositiva, ya que esto dará a los discos de mayor contraste. Los discos para los ojos / las antenas se unen a los lóbulos ópticos a través del tallo óptico en la parte posterior y las piezas bucales a través de un tallo esté desde el disco de las antenas en la parte anterior.
9. Para diseccionar los discos de los ojos tienen el aparato bucal con un par de pinzas y utilizar el otro par de separar los discos de los ojos del cerebro de larvas. A continuación separar los discos de los ojos de las piezas bucales. Por último, eliminar las piezas bucales de la diapositiva, ya que pueden evitar que el cubreobjetos por haber estado acostado.
10. Una vez disecada todos los discos de los ojos suavemente la inclinación de la diapositiva y secar el exceso de PBS. A continuación, agregue una gota de Vectashield y suavemente coloque un cubreobjetos en la parte superior.
11. Los discos ya están listos para ser captado por cualquiera de microscopía de epifluorescencia o confocal (Figura 2).

Resultados de la Representante

Cuando disecados correctamente el disco para los ojos / las antenas deben estar planos sobre el portaobjetos clara de los tejidos extraños, como el cerebro. Los polos dorsal y ventral del disco de los ojos son curvas y por lo tanto tienden a veces, pero esto puede ser evitado mediante la adopción de una serie Z en un microscopio confocal y la omisión de estas secciones de la proyección. Aunque el disco es un epitelio monocapa de las posiciones variables de los núcleos requieren una proyección de la serie Z para obtener una visión global del disco. Una proyección de un típico ojo-RFP para los ojos / disco antenal tomadas con un microscopio confocal se muestra en la Figura 2. Por lo general toman una micras secciones a través del disco usando una lente de 20x o 40x. El reportero del ojo-RFP se localiza nuclear y por lo que el patrón que se observa en la Figura 2 representa los núcleos de las células que expresan RFP.

Figura 1. Disección inicial del ojo / cerebro complejo de un ojo-RFP larva tercer estadio Drosophila. El ojo / antenal disco imaginal (descritos) pueden ser vistas adjunta a las piezas bucales (MP) y la superposición del lóbulo óptico (OC) del cerebro. La imagen fue tomada utilizando un microscopio de fluorescencia de disección para mostrar la expresión de RFP en el disco de los ojos. Anterior está a la izquierda. Barra de escala: 300 micras.

Figura 2. Expresión de los ojos del periodista-RFP en el disco imaginal del ojo. Un tercer ojo estadio (ED) / disco antenal (EA) disecado de una larva de ojos RFP RFP muestra la expresión (rojo). El disco estaba manchada con phalloidin (verde), que se tiñe la superficie apical de células y muestra el surco morfogenéticos (cabeza de flecha). RFP se expresa en las células precursoras de todo el MF, en fotorreceptores 1,6,7 y en las células del cono. Anterior está a la izquierda. Barra de escala: 25 micras.

Discusión

La disección del ojo disco imaginal de Drosophila es sencillo, pero puede tomar tiempo para dominar. Los pasos fundamentales son la identificación de los discos del ojo y su disección fuera del cerebro de larvas. Identificación de los discos del ojo se hace más fácil el uso de la línea de los ojos-RFP se describe aquí. Modificaciones posibles son para extraer el disco antenas o la membrana peripodial, o dejar el lóbulo óptico conectado a visualizar los axones de relaciones públicas en el cerebro.