Artículo de método

Visualizar la localización del ARN en Xenopus Los ovocitos

DOI:

10.3791/1704

⸱

14 de enero de 2010

 , 
1Department of Molecular Biology, Cell Biology, and Biochemistry, Brown University

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Aviso de erratum

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Resumen

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La visualización de In vivo ARN de transporte se realiza mediante la microinyección de la etiqueta fluorescente en las transcripciones de ARN Xenopus Ovocitos, seguido por microscopía confocal.

Resumen

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Localización del ARN es un mecanismo conservado del establecimiento de la polaridad celular. Vg1 ARNm se localiza en el polo vegetal de ovocitos de Xenopus laevis y actúa para restringir el espacio de expresión génica de la proteína Vg1. El control estricto de Vg1 distribución de esta forma es necesaria para la especificación adecuada capa germinal en el embrión en desarrollo. Elementos de la secuencia de ARN en el 3 'UTR del ARNm, el elemento de localización Vg1 (VLE) son necesarios y suficientes para el transporte directo. Para estudiar el reconocimiento y el transporte de Vg1 ARNm in vivo, hemos desarrollado una técnica que permite un amplio análisis de trans-factor de los mecanismos de transporte dirigido a través de una lectura visual simple.

Para visualizar la localización del ARN, que sintetiza la etiqueta fluorescente del ARN VLE y microinject esta transcripción en oocitos individual. Después del cultivo de ovocitos para permitir el transporte del ARN se inyecta, los ovocitos son fijos y deshidratado antes de la imagen por microscopía confocal. Visualización de patrones de localización del ARNm proporciona una lectura para el control de la vía completa de ARN de transporte y para la identificación de los roles en la dirección de ARN de transporte para el cis-elementos que actúan en la transcripción y factores de trans-acción que se unen a los VLE (Lewis et al., 2008, Messitt et al., 2008). Hemos ampliado esta técnica a través de co-localización con ARN y las proteínas adicionales (Gagnon y Mowry, 2009, Messitt et al., 2008), y en combinación con la interrupción de las proteínas motoras y el citoesqueleto (Messitt et al., 2008) de la sonda de mecanismos que subyacen a la localización del ARNm.

Protocolo

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Parte 1: La transcripción de ARNm marcado con fluorescencia.

  1. Linealizar el plásmido de ADN que contiene el elemento de localización del ARN o la secuencia pertinente y resuspender en 1 mg / l con DEPC tratados con H 2 O. La plantilla de ADN debe tener sitios aguas arriba promotor de la transcripción T7, SP6, T3 o ARN polimerasa.
  2. Añadir los siguientes reactivos a un tubo de 1,5 ml estéril:
    a. 10X buffer Tx (ver M & M) 2 l
    b. 20X tapa / mezcla de NTP (ver M & M) 1 l
    c. 1 mM Alexa Fluor 546-14-UTP (Invitrogen) 1 l
    d. UTP, [α-....

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Discusión

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Aquí hemos presentado un protocolo para visualizar la localización del mRNA en ovocitos de Xenopus. Este método, usando la etiqueta fluorescente transcripciones de ARN tiene una mayor relación señal-ruido de lo que se obtiene con la marcada con digoxigenina transcripciones y es más sencillo y más rápido de lo in-situ los enfoques basados ​​en (Mowry y Melton, 1992, Gautreau et al., 1997). Usando este método, podemos diseñar ARN secuencia de mutaciones y rápida prueba para la función in vivo. A.......

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Divulgaciones

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Los experimentos con animales de laboratorio se realizaron de acuerdo con las directrices y normas establecidas por la Universidad de Brown.

Agradecimientos

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Nuestro trabajo en la localización del ARN es apoyado por una subvención del NIH (R01GM071049) de KLM.

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Materiales

10X buffer Tx

  • 60 mM MgCl 2
  • 400 mM Tris-HCl (pH 7,5)
  • 20 mM espermidina-HCl

20x tapa / NTP mezcla

  • 10 mM CTP
  • 10 mM ATP
  • 9 mM UTP
  • 2 mM GTP
  • 20 mM G (ppp) G Cap analógica (New England Biolabs)

G-50 columna

  • 5 g de hidratos de Sephadex G-50 cuentas (Sigma Aldrich) en 100 mL de agua desionizada H 2 O. DEPC de tratar durante 30 minutos. y autoclave. Tienda de archivo incompleto a temperatura ambiente. Antes de usar, agregar lo siguiente RNasa libre de las soluciones:
  • 0,5 ml de 0,2 M EDTA
  • 1 ml 1 M Tris pH 8,0
  • 0,5 ml de 20% SDS
  • Tienda completa G-50 la solución a 4 ° C.
  • Retire y deseche el émbolo de una jeringa de 3 ml (BD Biosciences) y colocar el cilindro de la jeringa en un tubo cónico de 15 ml (Corning). Conecte la jeringa con una pequeña cantidad de lana de vidrio (un enchufe cerca de la mitad del tamaño de un centavo).
  • Remolino completa solución de G-50 para volver a suspender cuentas.
  • Añadir 2 ml de solución de G-50 a la columna vacía.
  • Giro de 1 minuto a 1000 x g en centrífuga de mesa.
  • Añadir 200 l tratada con DEPC H2O desionizada a cada columna. Spin.
  • Repetir el lavado dos veces más para un total de tres lavados.
  • Retire el cuerpo de la jeringa a un nuevo tubo de 15 ml cónicos.

Colagenasa solución

  • 75 mg de colagenasa de Clostridium histolyticum (Sigma Aldrich)
  • 25 ml 0,1 M KPO 3 + (pH 7,4)

MBSH buffer

  • 88 mM NaCl
  • 1 mM KCl
  • 2,4 mM de NaHCO3
  • 0,82 mM MgSO 4 7H 2 O X
  • 0,33 mM Ca (NO 3) 2 X 4 H 2 O
  • 0,41 mM CaCl 2 X 6 H 2 O
  • HEPES 10 mM (pH 7,6)

Ovocito medio de cultivo

  • 50% L15
  • 15 mM HEPES (pH 7,6)
  • 1 mg / ml de insulina
  • 100 mg / ml de gentamicina
  • 50 U / ml de nistatina
  • 50 U / ml de penicilina
  • 50 mg / ml de estreptomicina

MEMFA solución

  • 0,1 M MOPS (pH 7,4)
  • 2 mM EGTA
  • 1 mM MgSO 4
  • 3,7% de formaldehído

Informática ARN rendimiento

  • Determinar CPM en la "entrada" y "incorporado" las muestras usando un contador de centelleo estándar.
  • incorporación = ("incorporados") / (10 x "de entrada")
  • Los valores típicos de la incorporación rango entre ~ 0,03 y 0,10.
  • El rendimiento máximo teórico de diferentes polimerasas:
    T7, T3, SP6 - 2,64 mg
  • Reacción de rendimiento en mg = (rendimiento máximo de la polimerasa utilizada) X (incorporación)
  • Diluir el ARN de 50 nm = (ug RNA) / 320 / (longitud del ARN en las bases) / (5X10 -8)
  • La reacción suele producir ~ 50 a 100 l de ARN de 50 nm.

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cohen, S., Au, S., Pant, N. Microinjection of Xenopus laevis oocytes. JoVE. 24, (2009).
  2. Dumont, J. N. Oogenesis in Xenopus laevis (Daudin). I. Stages of oocyte development in laboratory maintained animals. J. Morphol. 136, 153-179 (1972).
  3. Gag....

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Erratum

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Formal Correction: Erratum: Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes
Posted by JoVE Editors on 6/10/2011. Citeable Link.

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Etiquetas

ARN fluorescenteMicroinyecci nMicroscop a confocalARNm de Vg1ARN de VLECultivo de ovocitosFijaci n deshidrataci nProte nas motoras

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