Cristalización de las proteínas de membrana para la Determinación de la estructura con mesofases lipídico

Summary

Aquí se describe el procedimiento aplicado en el Grupo de Biología de Membrana Caffrey estructurales y funcionales para establecer manualmente ensayos de cristalización de proteínas de la membrana lipídica en mesofases.

Abstract

Un protocolo detallado para la cristalización de proteínas de la membrana lipídica mediante el uso de mesofases se describe. Este método ha sido diversamente conocida como la fase cúbica lipídica o en el método de meso. El método ha demostrado ser muy versátil ya que se ha utilizado para resolver los rayos X las estructuras cristalográficas de proteínas procariotas y eucariotas, las proteínas que son monoméricos, homo y hetero-multimérica, cromóforo que contienen cromóforos y libre, y alfa -helicoidal y las proteínas beta-barril. Los recientes éxitos con la cristalización meso son los de la ingeniería beta2-adrenérgicos y los receptores de adenosina A2a acoplados a proteínas G. Protocolos se presentan para la reconstitución de la proteína de la membrana en la mesofase monoolein basado en, y para la creación de cristalizaciones en el modo manual. Medidas adicionales en el proceso global, como la cosecha de cristal, se abordan en los artículos de vídeo en el futuro. El tiempo necesario para preparar la mesofase proteína-cargado y la creación de una placa de cristalización de forma manual es de aproximadamente una hora.

Protocol

Un punto importante en el área de la biología estructural y funcional de la membrana biológica (Figura 1). La membrana que rodea las células y orgánulos subcelulares cuando está presente, es una estructura molecular fina sólo dos moléculas de lípidos en todo y está repleta de proteínas. Estructura y la función que se aplican tanto a los lípidos y las proteínas son de interés. Sin embargo, el foco de este artículo se limita a las proteínas de membrana.

Una mejor comprensión de cómo las proteínas de membrana de función a nivel molecular se busca por dos razones. En primer lugar, está la satisfacción intelectual de saber cómo funcionan. En segundo lugar, por saber cómo funciona una proteína, siempre existe la posibilidad de ser capaz de arreglar lo que funciona mal o de mejorar o incluso modificarlo para aplicaciones particulares. El diseño de fármacos es un resultado obvio de este tipo de trabajo. Un método para averiguar cómo una proteína de membrana trabaja a nivel molecular para determinar su estructura. Esto implica establecer el lugar en el espacio de 3 dimensiones de todos los átomos, o por lo menos todos los átomos no hidrógeno, que forman la proteína. El método que usamos para este propósito es macromoleculares cristalografía de rayos X (MX). La figura 2 muestra un ejemplo de una proteína de membrana cuya estructura se determinó a través MX. Un cristal de la calidad de la difracción de la proteína es necesaria para hacer MX.

Está claro que hay muchos pasos implicados en la determinación de la estructura utilizando cristalografía macromolecular. Esto se ilustra en la Figura 3. Por lo general, estos incluyen la identificación de un objetivo de proteína de la membrana, y luego la producción, purificación y cristalización del mismo. Medidas de difracción se llevan a cabo en el cristal con una casa o una fuente de sincrotrón de rayos-X. Los datos de difracción se procesan produciendo un mapa de densidad de electrones que se ajusta entonces con un modelo molecular. El modelo, al refinado, puede ser utilizado para explorar el mecanismo de acción de la proteína y de la estructura basada en el diseño de fármacos.

El enfoque de este artículo es mostrar cómo producir cristales de difracción de la calidad de las proteínas de la membrana lipídica con mesofases, por el llamado método de meso. Una reciente revisión del método y su alcance está disponible en la Referencia 1 (Caffrey, 2009). El protocolo de paso a paso vamos a seguir aquí se describe en la Referencia 2 (Caffrey y Cherezov, 2009).

Un diagrama de flujo que resume los pasos a seguir y el tiempo requerido para establecer un juicio en el meso cristalización de proteínas de membrana se muestra en la Figura 4. Este artículo cubre los pasos cerrados por líneas discontinuas de color rojo.

Parte 1: Preparación de las placas de cristalización

1. Posición de un portaobjetos de microscopio silanizada en el banco de trabajo.
2. Quite la cubierta del papel de protección de una superficie de una tira de cinta perforada de doble barra espaciador (disponible en el mercado, véase el cuadro de los reactivos y equipos específicos más adelante).
3. Coloque la cinta, el lado pegajoso hacia abajo, en contacto con la superficie de la diapositiva.
4. La presión de sellado de la cinta a la diapositiva con un rodillo o rodillo. Papel de aluminio se pueden colocar entre la cinta y el rodillo para proteger la base de los pozos.
5. Quite la cubierta del papel de la segunda cinta para exponer la superficie adhesiva superior.
6. Lugar individual cubreobjetos silanizada en las proximidades de la placa de sellado rápido y eficiente de los pozos tan pronto como se termine la carga.

Parte 2: Preparación de la jeringa de lípidos

1. Lugar de los lípidos (a menudo monoolein) en un bloque de temperatura controlada a 45 ° C durante 3 minutos para que sea fundido.
2. Mientras que los lípidos se está derritiendo preparar dos de 100 l Jeringas de gas Hamilton para su uso en el paso de los lípidos en proteínas de mezcla. Retire el casquillo de teflón de la jeringa que contiene la solución de proteína. Coloque la jeringa que se llevará a cabo los lípidos al lado de él (dejando a su férula en su lugar).
3. Conecte el acoplador (véase la tabla de los reactivos y equipos específicos y de referencia por debajo de 3 (Cheng et al., 1998)) a la jeringa de lípidos. Apretar el acoplamiento a la jeringa, pero no apriete en exceso. Retire el émbolo del barril de la jeringa de lípidos.
4. Tenga en cuenta que los lípidos debe ser fundida antes de proceder. Conjunto de la pipeta a 30 l y poco a poco ocupan aproximadamente 30 l de lípidos fundidos. Lentamente entregar la mayor cantidad de lípidos fundidos como usted puede en el extremo abierto de la jeringa con cuidado de no introducir burbujas de aire.
5. Coloque el émbolo en el cañón en contacto con el lípido fundido y avanzar lentamente el émbolo del barril de la jeringa en posición vertical como se demuestra en el vídeo. Las burbujas de aire que puede quedar atrapado por inadvertencia debe levantarse en el proceso y ser puesto en libertad.
6. Con cuidado, determinar el volumen de los lípidos en la jeringa mediante la lectura de las marcas en el cuerpo de la jeringa.
7. Deslice el ferrUle en la aguja que se extiende desde el empalme. Utilice el émbolo para el lípido fundido el cañón y lenta y suavemente en la aguja en el centro del acoplador.

Parte 3: Preparación de la jeringa de proteínas

1. La solución de proteína se debe girar a 14.000 g durante 5 a 10 minutos a 4 ° C para eliminar los agregados grandes antes de la creación de ensayos de cristalización. Retire la solución de proteína del hielo y deje que se equilibre a temperatura ambiente.
2. Calcular el volumen de la solución de proteínas de usar para formar la fase cúbica en o cerca de la hidratación completa. Para monoolein a 20 ° C, la hidratación con agua se produce en el agua cerca del 40% (en masa) como en el diagrama de fase ⁵ (Figura 5).
3. Con una jeringa de 25 o 50 L Hamilton tomar el volumen necesario de solución de proteína. Transferir la solución en la punta de teflón del émbolo en el cilindro de la jeringa de proteínas, teniendo cuidado de evitar las burbujas de aire.
4. Con cuidado, retire la aguja y medir el volumen de la solución de proteína en la jeringa. Que debe coincidir con el valor proporcionado en el paso anterior.
5. Poco a poco centímetros de la solución de proteína por el cañón para terminar a ras con el extremo abierto.
6. Enroscar la jeringa que la proteína en el extremo abierto del acoplamiento unido a la jeringa de lípidos. Es muy importante que el dispositivo no excesivamente apretado. Apretar demasiado el dispositivo montado mezcla en esta etapa puede dañar los casquillos y causar fugas. Menores de apretar también dará lugar a una fuga.

Parte 4: Solución de proteínas y lípidos de mezcla: Hacer que la mesofase

1. Para efecto de la mezcla, el avance del émbolo en la parte de proteína de la unidad montada de mezcla al límite, con el pulgar o el dedo índice de la conducción de la solución de proteína de la jeringa de proteínas, a través del acoplador y en la jeringa de lípidos.
2. El émbolo en la parte lipídica ahora se utiliza para conducir el contenido de la jeringa de lípidos de vuelta a través del enganche y con la jeringa de proteínas.
3. El proceso se repite muchas veces, de vez en cuando, un centenar de pasajes o más son necesarios para producir una mesofase homogénea. En el comienzo de la mezcla, el movimiento de material de ida y vuelta a través del acoplador puede ser desigual y, a veces, la fuerza extra que se necesita para llevar a cabo la mezcla. Mezcla inicial suele ir acompañada por el desarrollo de una nubosidad no uniforme en la muestra. Como la homogeneización progresa, la textura se vuelve más uniforme y característica de la fase cúbica viscoso, al igual que el aspecto visual de la mesofase emergentes cúbicos.
4. Si las condiciones son adecuadas y las formas de fase cúbica, la dispersión debe aparecer ópticamente transparente en la jeringa. Por lo tanto, las marcas en el cuerpo de la jeringa debe ser claramente legible a través de la mesofase en el barril.
5. Enfriamiento muy leve de la muestra durante la mezcla mediante la colocación de la mesa de mezclas jeringa por un corto tiempo en el hielo puede acelerar la homogeneización y el logro de la transparencia. Sin embargo, es importante que no se enfríe la muestra.
6. Se debe tener cuidado para evitar la mezcla muy fuerte, ya que esto puede hacer que la temperatura de la muestra en aumento debido al calentamiento por fricción ^3.

Parte 5: Carga del dispensador

1. Retire la aguja y el émbolo de una jeringa de 10 l Hamilton. Dejar el casquillo de teflón en el lugar.
2. Retire la tuerca de retención del distribuidor con la ayuda de una moneda pequeña.
3. Con el brazo de trinquete retirado completamente, inserte la jeringa - sin su émbolo y la aguja - a través del anillo de sujeción del distribuidor.
4. Vuelva a colocar la tuerca de retención, frente a la junta de lado la jeringa, y el tornillo de fuerza en el extremo abierto de la jeringa.
   Se debe tener cuidado para asegurarse de que la jeringa esté bien centrada en el anillo de sujeción y de que el barril se alinea paralelo al brazo de trinquete. Ambos pueden ser juzgados por los ojos. Estos dos requisitos son fundamentales para evitar las fugas.
5. Pase el émbolo a través de la arandela de sujeción con la tuerca de sujeción desenroscar un par de vueltas y la guía del émbolo en el extremo abierto de la jeringa. Presione el brazo de trinquete en su totalidad. Mover el émbolo en el cañón y comprobar que se desplaza libremente y verdadero en el barril. Puede ayudar a aflojar el tornillo de la barra de guía para facilitar el émbolo se mueva libremente. Asegúrese de que lo hace. El émbolo hasta que la punta de teflón se alinea con la línea de graduación cero l en el barril. Si el tornillo de la barra guía se aflojó, se vuelva a apretar una y otra vez que el émbolo se mueve libremente.
6. Mover el émbolo en un lado de la unidad montada de mezcla para la marca de graduación l cero a la transferencia de la mesofase a la otra jeringa y el acoplador.
7. Desconecte la jeringa vacía (con su férula en su lugar) de la unidad de mezcla y de inmediato conecta la jeringa cargada - con un acopladorttached - a la terminación de rosca de la jeringa de 10 l de dispensación. El grado de rigidez con la que el acoplamiento se lleva a cabo es fundamental, como ya se señaló.
8. Cargue la jeringuilla con el émbolo de la jeringa de 100 l para que las transferencias mesofase a través del acoplador.
9. Asegurar un corto, la aguja de punta plana para la terminación de acero de la jeringuilla y cuidadosamente apriete en su lugar.
10. Sujete el émbolo para el brazo de trinquete apretando la tuerca de la arandela de sujeción. Se debe tener cuidado de no sobre-apretar la tuerca, ya que esto puede marcar y deformar el émbolo éste no podrá utilizarse. Es importante que el rango de los viajes siempre en el brazo de trinquete en la condición fijada se limitará a no más de una pulgada, como se demuestra en el vídeo. Más allá de esto, el émbolo tiene una tendencia a la hebilla y la entrega puede fallar.
11. Presione el tambor de carraca en varias ocasiones para avanzar el émbolo en el barril, con lo que llenar el volumen vacío de la aguja y la carga de la aguja. Este paso se debe repetir (hasta diez veces) hasta que una cadena continua de la mesofase sale de la punta de la aguja.
12. Ensayos de cristalización debe comenzar de inmediato, ya que algunas proteínas son inestables en la fase cúbica sin precipitante añadido.

Parte 6: Configuración de Placas de Cristalización

1. Colocar una placa de cristalización de varios bien y cubreobjetos sobre una superficie elevada a unos cuantos centímetros por encima de la mesa de trabajo para facilitar la carga. Un contraste óptimo y mejorar la visibilidad se consiguen cuando la superficie está un poco oscuro.
2. Homogeneizar las soluciones precipitantes y destape los frascos. Establecer el desencadenante pipeta de dosificación a 1 mL.
3. Con la jeringa dosificadora en posición vertical en una mano, utilice la mano libre para la posición de la punta de la aguja en el centro y justo encima de la base del número y 1. Pulse el botón del expendedor de la repetición de expulsar a un bolo de mesofase en la superficie del vidrio. El volumen del bolo es de 200 nL cuando el dispensador estándar de repetir se utiliza con una jeringa de 10 mL. La punta de la aguja no debe ser mayor de unos cientos de micras por encima de la base del bien para garantizar la entrega correcta.
4. Después de 4 pozos adyacentes están llenas de mesofase, colocar 1 l de solución de precipitación en la parte superior de cada bolo mesofase usando una pipeta de 2-l y el nivel puntas desechables.
5. Tan pronto como sea posible, coloque un cubreobjetos de lleno en los pozos llenos para cubrir de manera uniforme. Para efectuar un sellado hermético, use una espátula para aplicar presión sobre el cubreobjetos donde hace contacto con la superficie expuesta de la cinta adhesiva espaciador.
6. La mesofase y precipitado proceso de dosificación se puede repetir hasta que todos los pozos de la placa se cargan y se sellan.
7. Etiqueta de la placa claramente con fines de seguimiento. Sensibles a la luz las proteínas son generalmente manejados por envolviendo las placas en papel de aluminio antes de colocarlas en la cámara de incubación.
8. Coloque las placas en una cámara de temperatura controlada, por lo general a 20 ° C.
9. En un horario regular, inspeccionar los pozos para el crecimiento de los cristales usando un microscopio de luz polarizada con un objetivo de 10 o 20 veces. La programación utilizada en el laboratorio del autor es la siguiente: el día 0, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 21, 30 y 60 posterior a la instalación. Inspeccione cuidadosamente el bolo mesofase ajustar la profundidad de foco dentro de la muestra 0,14 mm de espesor. El examen debe hacerse tanto en la luz normal y entre los polarizadores cruzados.

Parte 7: Resultados de Representante

La aparición de los cristales resultantes pueden variar con el color propio de la proteína de la membrana, la polarización de la luz utilizada para la inspección (o su ausencia) y el método y la calidad de la iluminación. La Figura 6 muestra varios aspectos de cristal posible. Proteínas de la membrana de colores naturales que crecen en meso cuando se ve con luz normal puede verse como los que se muestran en la Figura 6 (Grupos B y D). Cristales incoloros proteína de membrana que crece en la fase cúbica cuando se ve con luz normal puede verse como los que se muestran en la Figura 6 (Grupo E). Por último, incoloro cristales de proteína de membrana que crece en meso cuando se ve con luz polarizada puede verse como la figura 6 (paneles A y C).

Los próximos pasos en el proceso general de determinación de la estructura son de la cosecha y la crio-fría los cristales y para registrar y analizar difracción de rayos X de ellos. Estos temas deben ser incluidas en los artículos JoVe separado.

Figura 1. Representación esquemática de una membrana biológica que muestra la bicapa lipídica y en la que se encuentran una variedad de proteínas.

Figura 2. La estructurade la vitamina B ₁₂ proteína transportadora, BtuB, resuelto con MX y los cristales cultivados por el método meso ⁶ se ilustra en este artículo Jove.

Figura 3. El ciclo de estructura-función ilustra muchos de los pasos necesarios para obtener y utilizar la información completa sobre la estructura de una proteína.

Figura 4. El diagrama de flujo resume los pasos involucrados en la producción de cristales de proteína de la membrana por el método meso. Sólo los pasos rodeado por la línea discontinua de color rojo están cubiertas en este artículo Jove. De referencia 2.

Figura 5. Simplificado de temperatura-composición para el diagrama de fase lipídica (monoolein) / sistema de agua. Ensayos de cristalización se establecen a 20 ° C en los lípidos saturados con agua en un 40% de hidratación. El diagrama de fase más amplia se encuentra en la Referencia 5.

Figura 6. Cristales de proteínas de membrana que crece en la mesofase lipídica.
(A) de vitamina B ₁₂ proteína transportadora, BtuB ^6, (b) que recoge la luz del complejo II ^7, (c) la OPCA adhesina / invasina ^8, (d) bacteriorodopsina ^9, (e) un transportador de hidratos de carbono a partir de Pseudomonas. Las imágenes grabadas con luz normal (b, d, e) y entre los polarizadores cruzados (a, c).

Discussion

La fase cúbica es un entorno delicado y dinámico que puede cambiar drásticamente con la alteración de una serie de variables. No es posible dar una descripción de la configuración de los ensayos de cristalización meso en el modo manual que describe todos los posibles escollos. Sin embargo, las dificultades se pueden evitar muchos de práctica de la técnica antes de aplicarla a las soluciones de proteínas caro y con moderación en la presión aplicada a las jeringas durante la mezcla. Hecho correctamente, el método de meso puede producir cristales de una gran variedad de proteínas, cuyo número aumenta constantemente.

La descripción dada aquí de la configuración de los ensayos de cristalización meso se centra en el modo manual. El proceso puede ser, ya menudo se ha modificado para facilitar la instalación automática de las placas de cristalización en aquellos casos que requieren de gran escala de detección de condiciones de cristalización.

Materials