Expresión de proteínas recombinantes en la levadura metilotrófica Pichia pastoris</em

Resumen

El protocolo describe la expresión de proteínas utilizando la levadura metilotrófica Pichia pastoris. La preparación de células de levadura electrocompetentes, la transformación del vector con el gen de interés en P. pastoris Y purificación del ADN de levadura también se realizan. Western blot y purificación de proteínas construir los últimos pasos en este protocolo expresión de la proteína.

Resumen

Expresión de la proteína microbiana en el pastoris eucariotas Pichia anfitrión ofrece la posibilidad de generar grandes cantidades de proteínas recombinantes en un sistema de expresión rápida y fácil de usar.

Como P. microorganismos unicelulares pastoris es fácil de manipular y crece rápidamente en los medios de comunicación de bajo costo en altas densidades de células. Ser una célula eucariota, P. pastoris es capaz de realizar muchas de las modificaciones posteriores a la traducción realizada por el aumento de las células eucariotas y las proteínas recombinantes obtenidas se someten plegamiento de proteínas, procesamiento proteolítico, la formación de enlaces disulfuro y glicosilación [1].

Como la levadura metilotrófica P. pastoris es capaz de metabolizar el metanol como única fuente de carbono. El gran promotor de la alcohol oxidasa, AOX1, está estrechamente regulada e inducidos por el metanol y se utiliza para la expresión del gen de interés. En consecuencia, la expresión de la proteína extraña puede ser inducida mediante la adición de metanol en el medio de cultivo [2, 3].

Otra ventaja importante es la secreción de la proteína recombinante en el medio de cultivo, utilizando una secuencia de señales para orientar la proteína extraña a la vía secretora de P. pastoris. Con bajos niveles de proteína endógena secretada a los medios de comunicación por la propia levadura y no proteínas añadidas a los medios de comunicación, una proteína heteróloga se basa la mayoría de las proteínas totales en el medio y facilita los siguientes pasos de purificación de proteínas [3, 4].

El vector utilizado (pPICZαA) contiene el promotor AOX1 para mejor regulado, metanol inducida por la expresión del gen de interés, la señal de secreción de α-factor de la secreción de la proteína recombinante, un gen de resistencia Zeocin para la selección, tanto en E. coli y Pichia y un péptido C-terminal que contiene el epítopo c-myc y polihistidina (6xHis) etiqueta para la detección y purificación de proteínas recombinantes. También muestra el análisis de Western blot de la proteína recombinante utilizando el específico anti-myc-HRP anticuerpo que reconoce el epítopo c-myc en el vector de los padres.

Protocolo

Expresión de proteínas recombinantes en la levadura Pichia pastoris metilotrófica

Antes de iniciar este protocolo que debe tener su gen de interés clonado en el marco de una P. vector pastoris padres y lo han secuenciado para comprobar la correcta inserción del gen de interés en el vector.

Paso I: La generación de células de levadura electrocompetentes, linealización de la construcción y transformación en P. pastoris

Para este paso, tendrá que tener los siguientes medios y platos a mano:

• YPDS placas
• 600 ml de YPD medio

Discusión

Expresión de la proteína con la levadura Pichia pastoris metilotrófica como sistema anfitrión se describe en este protocolo. La proteína puede ser secretada en el medio en función del vector de clonación usada. La secreción de la proteína recombinante hace más fácil la posterior purificación. Sin embargo, las condiciones que se muestran pueden tener que ser optimizado para la expresión de proteínas diferentes y los cambios en las condiciones y los tiempos de la expresión puede resultar en niveles de aumento de .......