La fertilización de Oocitos de Xenopus Utilizando el método de transferencia de acogida

Resumen

Procedimiento para la fertilización Oocitos de Xenopus Por el método de transferencia de acogida.

Resumen

Estudiar la contribución de las moléculas de herencia materna a la vertebración de desarrollo temprano a menudo se ve obstaculizada por el tiempo y los gastos necesarios para generar animales de la madre y el efecto mutante. Además, muchas de las técnicas para sobreexpresar o inhiben la función de genes en organismos tales como Xenopus y pez cebra no objetivo suficientemente crítica materna vías de señalización, como la señalización de Wnt. En Xenopus, la manipulación de la función de genes en ovocitos cultivados y su posterior fertilización puede mejorar estos problemas hasta cierto punto. Los ovocitos son manualmente defolliculated de tejido de un donante de ovario, inyectado o tratado en la cultura como se desee, y luego estimulados con progesterona para inducir la maduración. A continuación, los ovocitos se introducen en la cavidad del cuerpo de una rana anfitrión ovulación femenina, con lo cual se trasladaron a través del oviducto del anfitrión y adquirir las modificaciones y abrigos de gelatina necesaria para la fecundación. Los embriones resultantes se puede elevar a la fase deseada y se analizaron los efectos de cualquier perturbación experimental. Este método de transferencia de acogida ha sido muy eficaz en el descubrimiento de los mecanismos básicos del desarrollo inicial y permite una amplia gama de posibilidades experimentales no están disponibles en cualquier organismo vertebrado otro modelo.

Protocolo

1. La extirpación quirúrgica de tejido ovárico

1. Preparar un nuevo lote de medio de cultivo de ovocitos (OCM; Materiales), entre 400-800 ml, dependiendo del tamaño del experimento. Ajustar el pH a 7,6-7,8, hasta que el rojo fenol se vuelve un color rojo oscuro (seis o más gotas de NaOH 5 N). Vierta una pequeña cantidad para comprobar el pH en un tubo separado desde el electrodo de pH pueden contaminar los medios de comunicación. OCM deben ser almacenados a 18 º C y utilizarse dentro de una semana.
2. Seleccione 3-5 hembras y un lugar en ~ 2L buffer solución anestésica (Materiales). Tratamos de evitar el uso de las ranas que se alimentan....

Discusión

Un éxito de la transferencia dará lugar a la fecundación y la división normal de> 50% de los ovocitos (Figura 3). Generalmente entre 30-60% de los ovocitos transferidos sobreviven más allá de las etapas Néurula. Por lo general, la transferencia de ovocitos desde 75 hasta 150 por grupo experimental, que dará embriones suficiente para varios tipos de análisis (in situ, RT-PCR), así como visualizar el fenotipo. La implantación de ovocitos mucho más no parece aumentar considerablemente el rendimiento. Además, por lo meno.......

Materiales

Soluciones y recetas:

OCM (ovocitos medio de cultivo modificado a partir de Wylie et al, 1996).

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
70% L-15 de Leibovitz medio (que contiene L-glutamina)	(Invitrogen 11415-064)
0,4 mg / ml de albúmina de suero bovino (BSA, fracción V)	(Sigma A-9418-50 g)
1x penicilina-estreptomicina	(Sigma P-0781)
Ajustar el pH a 7,6-7,8 con NaOH 5 N
Hacer nuevas tiendas cada semana, a 18 ° C.

10X MMR (solución modificada de Marc Ringer;. Zuck et al, 1998)

1M NaCl
20 mM KCl
20 mM de CaCl2
10 mM de MgCl 2
150 mM HEPES
ajustar el pH a 7,6-7,8
Almacenar a 4 ° C

Solución anestésica

1 g / L 3-aminobenzoico éster etílico del ácido (MS222)	(Sigma A-5040)
0,7 g / L de bicarbonato de sodio
Disolver en agua tratada con Amquel
Hacer fresco por semana

Las poblaciones de progesterona

10 mM de progesterona (Sigma P-0130) en el 100% de etanol
Diluir a 1 mM en EtOH al 100% de una población 500 veces / solución de trabajo
Almacenar a -20 ° C

Colorantes vitales (modificado de Heasman et al., 1991)

Azul: 0,1% del Nilo Azul A	(Aldrich 121479-5G),
Red: Red Neutral 0,25%	(Sigma N-6634),
Brown: 1% Bismarck Brown	(Sigma B-2759),
Verde (80 azul l + 80 l marrón),
Malva (80 + 80 l azul rojo l).
Un color sexto, Orange (80 l rojo + 80 l marrón), también se puede utilizar, pero es a menudo difícil de distinguir de color marrón.

Las existencias de azul, rojo y marrón se preparan en agua desionizada en tubos de 50 ml, se incubó durante 20 minutos con la oscilación y la hace girar en una centrífuga clínica. Los sobrenadantes se alícuotas en tubos de microcentrífuga y se almacenan a -20 ° C.