Este video muestra la técnica utilizada para la preparación de organizador y explantes de animales polo de Xenopus laevis embriones, incluyendo el uso de la cuchilla de cejas - una herramienta especializada disección hecha de una de las cejas. El protocolo para el montaje de un ensayo de adhesión se da también, que las sondas para detectar la presencia de moléculas de adhesión clave presentes en el organizador de la superficie de las células animales o polos que son fundamentales para un desarrollo adecuado.
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Artículo de método
La disección del Organizador y explantes Animal Polo de Xenopus laevis embriones y de la Asamblea de un ensayo de adhesión celular
En este artículo
Resumen
Protocolo
Preparación de Cámaras de adhesión (el día antes de la inyección / disección)
Cámaras de ensayo de adhesión
Si usted tiene un microscopio convencional (óptica localiza sobre el escenario), es ncecessary para hacer una baja altura de la cámara de la adhesión de la siguiente manera. Si se utiliza el microscopio invertido óptica, a continuación, "NUNC Lab-Tek cubreobjetos Recamarado" sólo se puede utilizar, y saltarse los pasos # 1 - 2.
- Conecte uno de los "presione para sellar aislante de silicio", en una hoja de 40 x 24 mm cubierta. Presione firmemente el aislante de la cubierta antideslizante en la mesa....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios | |
|---|---|---|---|---|
| 1x MBS-H | Tampón | Barth modificado’s medio: receta para 1 L: 5,14 g de NaCl, 75 mg de KCl, 0,2 g de NaHCO₃3 0.2 g de MgSO₄4•7H2O 60 mg de CaCl2•2H2O 80 mg Ca(NO3)2•4H2O2. 38 g de HEPES, ácido libre. Ajustar el pH a 7,4 con NaOH. Autoclavar. | ||
| CMF-MBS | Tampón | Este es Ca2+/Mg2+-versión libre de MBS-H. Receta de 500 mL: 2,57 g de NaCl, 37,5 mg de KCl, 0,1 g de NaHCO₃3/sub> 1,19 g de HEPES, ácido libre. Ajustar el pH a 7,4 con NaOH. Autoclavar. | ||
| agarosa al 1 %/Barth 1x’placas s | tantos como el número de muestras | |||
| placas de agarosa al 1 %/CMF-MBS | tantos como el número de muestras | |||
| Cádmherina E/Fc quimérica | Reactivo | Sigma-Aldrich | E-2278 | Disuelva 0,1 mg de E-cadherina sólida en 100 μl de MBS-H 1x que contenga 40 % de glicerol para obtener un stock maestro 100x (1,0 mg/ml). Almacénelo en –20 °C. Realice una dilución 1/100 con MBS-H 1x para obtener una solución de trabajo de 10 μg/ml justo antes de usarla. Necesitará 200 μl por muestra de esta solución de trabajo. |
| Fibronectina, solución al 0,1 % | Reactivo | Sigma-Aldrich | F-1141 | Esta solución preelaborada puede utilizarse como solución madre 50x. Realice una dilución 1/50 con MBS-H 1x para obtener 20 μsolución de trabajo g/mL justo antes de usarla. Necesita 200 μL por muestras de esta solución de trabajo. NO recomiendo usar fibronectina sólida, porque es difícil disolverla a una concentración del 0,1 % para preparar la solución madre. Aunque es más costosa, esta solución preelaborada al 0,1 % es preferible para obtener resultados consistentes. |
| 4% BSA / MBS-H | Tampón | BSA: fracción V de grado biología molecular | ||
| Puntas amarillas Sigmacoted | Herramienta | |||
| Cubreobjetos n.º 1 | 40 mm x 24 mm o 60 mm x 24 mm | |||
| Aislante de silicona de sellado por presión | Herramienta | Glace Bio-Labs | JTR20-2.5 | 2,5 mm de profundidad x 20 mm de diámetro |
| NUNC Lab-Tek Chambered Coverglass | Herramienta | Fisher Scientific | 12-565-471 | 2 pocillos/placas |
| Lámina de vidrio con rejilla | Herramienta | o retículo de Finder para el recuento de células |
Reimpresiones y permisos
