Artículo de método

Microscopía óptica de dispersión basado en dos dimensiones filtros Gabor

DOI:

10.3791/1915

2 de junio de 2010

En este artículo

Resumen

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Demostramos un método de microscopía de campo oscuro, sobre la base de Gabor-como el filtrado para medir la dinámica subcelulares dentro de células vivas individuales. La técnica es sensible a las alteraciones en la estructura de los orgánulos, como la fragmentación de las mitocondrias.

Resumen

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Demostramos un instrumento microscópico que puede medir la textura subcelular derivados de la morfología orgánulo y la organización dentro de células vivas sin teñir. El instrumento propuesto se extiende la sensibilidad de la etiqueta sin microscopía óptica a nanoescala cambios en el tamaño y la forma de orgánulos y se puede utilizar para acelerar el estudio de la relación estructura-función relativa a la dinámica de los procesos biológicos subyacentes orgánulos fundamentales, como la muerte celular programada o celular diferenciación. El microscopio se puede implementar fácilmente en las plataformas de microscopía existentes, y por lo tanto se puede difundir a los distintos laboratorios, donde los científicos pueden implementar y utilizar los métodos propuestos con un acceso sin restricciones.

La técnica propuesta es capaz de caracterizar la estructura subcelular mediante la observación de la célula a través de dos dimensiones ópticas filtros de Gabor. Estos filtros se puede ajustar a nanoescala con sentido (10 de nm) la sensibilidad, los atributos específicos morfológicas relacionadas con el tamaño y la orientación de la no-esférica organelas subcelulares. Aunque basado en el contraste generado por la dispersión elástica, la técnica no se basa en un modelo de dispersión inversa detallado o en la teoría de Mie para extraer medidas morfométricas. Esta técnica es aplicable a los no-esférica orgánulos que una descripción precisa de dispersión teórica no es fácil dado, y proporciona distintivo parámetros morfométricos que se pueden obtener dentro de células vivas sin teñir para evaluar su función. La técnica es ventajosa en comparación con el procesamiento digital de imágenes en que opera directamente en el campo del objeto transformar en vez de la intensidad del objeto discretizado es. No se basa en altas tasas de muestreo de la imagen y por lo tanto se puede utilizar para detectar rápidamente la actividad morfológica dentro de cientos de células a la vez, por lo que facilita en gran medida el estudio de la estructura del orgánulo más allá de la segmentación de cada orgánulo y la reconstrucción mediante microscopía de fluorescencia confocal de gran aumento imágenes digitales de los campos de visión limitado.

En esta demostración se muestran los datos de una diatomea marina para ilustrar la metodología. También muestran los datos preliminares recogidos de las células vivas para dar una idea de cómo el método puede ser aplicado en un contexto biológico relevante.

Protocolo

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1. Cómo las células listo

  1. Las células que se cultivaron el día anterior necesita ser etiquetado con el verde Mitotracker para imágenes de fluorescencia de las mitocondrias.
  2. Quitar una solución de 100 M de acciones verde Mitotracker en DMSO hecho antes de los 4 ° C congelador, y la temperatura ambiente con la mano. También sacan células endoteliales de aorta bovina (BAEC) medio de cultivo celular también previamente preparado y caliente a 37 ° C en el baño de agua de mesa.
  3. Una vez que el Mitotracker y medio de cultivo se calientan, los sitúan en el capó y asegúrese de esterilizar sus manos con guantes y todas las superficies externas de ....

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Discusión

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El método descrito anteriormente mapas de rendimientos morfométricas del objeto que puede codificar el tamaño de partícula o de orientación, por ejemplo. Esta información estructural se puede utilizar de varias maneras:

  1. Puede ser utilizado como una pantalla inicial para identificar las regiones de tejido o células que se alteran durante un tratamiento específico y luego seguir analizando estas regiones con particularidades técnicas moleculares y bioquímicos.
  2. Puede ser usado en conjunción con fluor.......

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Divulgaciones

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Algunos aspectos de los métodos se han incluido en y divulgación de la invención, la Universidad de Rutgers etiqueta # 09-049.

Agradecimientos

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El dispositivo de micro-espejos-en esta investigación fue financiada por beca de la Fundación Whitaker RG-02 a 0,682 a N. Boustany. Trabajo en curso es financiado por la subvención NSF-DBI-0852857 de N. Boustany. Pasternack RM fue parcialmente financiado por una beca de Rutgers Presidencial de Posgrado. También nos gustaría agradecer al Dr. E. White para que las células iBMK utilizados en nuestros estudios y Metaxas Dr. DN útil para el debate sobre las estrategias de filtrado óptico.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
DMEMInvitrogenGlucosa baja DMEM
Liebowitz L15 medioInvitrogenSin fenol
L-glutaminaInvitrogen
Mitotracker GreenInvitrogen
Extracto de cerebro bovinoClonetics
Suero bovino fetalGemini Bio Productos
HeparinaSigma-Aldrich
StaurosporinaSigma-Aldrich
DimetilsulfóxidoSigma-Aldrich
Microscopio invertidoCarl Zeiss, Inc.Axiovert 200M
DMDTexas InstrumentsTI 0.7 XGA DMD 1100
CCDRoper ScientificCascase 512BCCD de alto rango dinámico (16 bits)
CCDCCD Roper ScientificCoolsnap cf
roja

Referencias

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  1. Pasternack, R. M., Qian, Z., Zheng, J. -Y., Metaxas, D. N., White, E., Boustany, N. N. Measurement of Subcellular Texture by Optical Gabor-Like Filtering with a Digitial Micromirror Device. Optics Letters. 33 (19), 2209-2211 (2008).
  2. Pasternack, R. M., Qian, Z., Zheng, J. -Y., Metaxas, D. N., Boustany, N. N.

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Fragmentaci n mitocondrialdetecci n de apoptosisestructura subcelularimagen sin marcadoresmorfolog a de org nulosimagen de campo oscurovalidaci n de fluorescenciaan lisis de diatomeas

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