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Este protocolo es un extracto de Sarasija y Norman, Medición de las tasas de consumo de oxígeno en Caenorhabditis elegans intacto, J. Vis. Exp. (2019).
>1. Crecimiento y sincronización de la población de nematodos
Estos animales alcanzarán la etapa larvaria L4 después de ~42 h. En este momento, mueva las larvas L4 con un pico de platino a placas NGM sembradas con OP50 que contengan 0,5 mg/mL de 5-fluoro-2'-desoxiuridina (FUdR) para evitar que produzcan progenie.
NOTA Asegúrese de que dentro de un experimento todas las cepas estén sincronizadas durante un período de tiempo similar. El tratamiento con FUdR esteriliza a los animales y evita la puesta de huevos y la producción de progenie, lo que podría influir en el OCR. Estos animales esterilizados se analizarán al día siguiente (día 1 animales adultos a ~66 h) para el ensayo. Se ha informado que FUdR afecta la fisiología y la vida útil de ciertos gusanos mutantes. Por lo tanto, esto debe tenerse en cuenta cuando el medicamento se usa para la esterilización. Los gusanos también pueden ser esterilizados por medio de mutaciones feminizantes como fem-1(hc17) o fem-3(e2006). Sin embargo, estas mutaciones podrían afectar la función mitocondrial.
- Transfiera las larvas L4 de los antecedentes genéticos deseados (por ejemplo, animales N2 [tipo salvaje] y sel-12) a placas de medios de crecimiento de nematodos (NGM) (consulte la Tabla 1 para la receta) recién sembradas con un césped de Escherichia coli (OP50). Utilice al menos dos placas de 100 mm o tres de 60 mm para cada cepa. Incubar los gusanos a la temperatura de crecimiento adecuada (entre 15 y 25 °C) durante 3 o 4 días o hasta que las placas se concentren con un gran número de huevos y gusanos grávidos.
- Lave los huevos y los gusanos de las placas utilizando aproximadamente 6 mL de tampón M9 (consulte la Tabla 1 para la receta) por placa de 100 mm de nematodos y transfiéralos con pipetas Pasteur de vidrio a tubos de centrífuga individuales de 15 mL para cada cepa. Gire estos tubos hacia abajo durante 3 minutos a 6.180 x g y aspire el tampón M9, reteniendo solo los animales y los huevos.
- Agregue 3-4 mL de solución de lejía (consulte la Tabla 1 para la receta) a cada tubo y vórtice intermitente durante 6 min. Agregue tampón M9 para llenar cada tubo y centrifugue a 6,180 x g durante 1 min y aspire el sobrenadante. Repita este lavado con M9 tres veces y mueva el pellet de huevo a un tubo nuevo de 15 mL que contenga aproximadamente 9 mL de tampón M9.
- Sincronice los gusanos recién eclosionados nutando a 20 °C durante 16-48 h. Gire estos tubos a 6.180 x g durante 1,5 min y coloque los animales L1 sincronizados en placas individuales de NGM recién sembradas con un césped de OP50 (aproximadamente 6.000-10.000 animales por placa de 100 mm) y manténgalos a 20 °C.