Servicio de transporte molecular que consiste en deslizarse sobre los microtúbulos funcionalizados superficie adherido kinesin proteínas motoras pueden servir como un sistema de transporte a nanoescala. En este caso, el montaje de un sistema de transporte típico se describe.
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Artículo de método
Las operaciones de carga en Kinesin molecular Traslados Desarrollado
En este artículo
Resumen
Resumen
Las células han desarrollado mecanismos moleculares sofisticadas, como las proteínas motoras kinesina y filamentos de microtúbulos, para apoyar el transporte activo intracelular de la carga. Mientras que la cola de dominio kinesins se une a una variedad de cargas, los dominios kinesins cabeza utilizar la energía química almacenada en moléculas de ATP al paso a lo largo de la red de microtúbulos. Los microtúbulos largas y rígidas sirven como pistas para el transporte de larga distancia intracelular.
Estos motores y los filamentos se pueden emplear también en microfabricated entornos sintéticos como componentes del servicio de transporte molecular 1. En un diseño de uso frecuente, los motores de quinesina se anclan a la superficie de la pista a través de sus colas, y los microtúbulos funcionalizados servir como elementos de transporte de carga, que son impulsados por estos motores. Estas naves se pueden cargar con la carga mediante la utilización de la unión fuerte y selectiva entre biotina y estreptavidina. Los componentes clave (tubulina biotina, estreptavidina, biotina y de carga) están disponibles comercialmente.
Basándose en el ensayo de la motilidad clásico invertido 2, la construcción de lanzaderas moleculares se detalla aquí. Kinesin proteínas motoras son adsorbidos en una superficie recubiertas con caseína, los microtúbulos de tubulina se polimerizan con biotina, se adhirió a la quinesina y posteriormente recubiertos con estreptavidina marcada con rodamina. La concentración de ATP se mantiene a una concentración subsaturating para lograr una velocidad de deslizamiento de microtúbulos óptima para operaciones de carga 3. Por último, biotina marcado con fluoresceína nanoesferas se agregan como carga. Nanoesferas se adhieren a los microtúbulos, como resultado de colisiones entre los microtúbulos deslizándose y nanoesferas adherirse a la superficie.
El protocolo puede ser fácilmente modificado para cargar una gran variedad de cargas, como el ADN biotinilado 4, 5 o puntos cuánticos una amplia variedad de antígenos mediante anticuerpos con biotina 4-6.
Protocolo
1.) Buffers y Reactivos
Estas soluciones deben prepararse con antelación y se almacena en alícuotas de tamaño conveniente. Una alícuota deberá contener solución suficiente para un experimento típico y una alícuota se debe utilizar para cada ensayo de motilidad. Las condiciones de almacenamiento y los tamaños típicos alícuota también se mencionan en los siguientes protocolos.
1. BRB80 buffer, (80 TUBOS mM, MgCl2 1 mM, EGTA 1 mM en agua desionizada destilada (dd) de agua, pH ajustado a 6,9 por KOH)
- Constituyen una solución de 100 ml de caldo de 0,5 M EGTA en agua dd. Ajustar el pH a 7.0 con 2 ....
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Discusión
Con pequeñas modificaciones, este protocolo ha sido utilizado con éxito por una variedad de grupos para montar kinesina-microtúbulo ensayos de movilidad basado en. 10 mM de TDT en la solución final de la motilidad puede ser reemplazado con un 0,5% β-mercaptoetanol. Soluciones estándar (BRB80AF, KIN20 y MT1000) de más de 2 horas de vida no se debe utilizar. Cualquier solución que contiene microtúbulos taxol y sobre todo nunca deben ser colocados en el hielo. La exposición excesiva de la celda de flujo a los rayos UV los .......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Estamos muy en deuda con Jonathon Howard, cuyo grupo desarrolló el protocolo básico para un ensayo de la motilidad de deslizamiento, que fue adaptado posteriormente por nosotros. El apoyo financiero de NSF concesión DMR0645023 se agradece.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Adenosina-5’-trifosfato (ATP) | Invitrogen | A1049 | |
| Tubulina biotinilada | Cytoskeleton, Inc. | T333 | |
| Casena | Sigma-Aldrich | C-0376 | |
| Catalasa | Sigma-Aldrich | C-9322 | |
| D-(+)-Glucosa | Sigma-Aldrich | G-7528 | |
| Dimetilsulfóxido (DMSO) | Sigma-Aldrich | D-8779 | |
| Ditiotreitol (DTT) | Bio-Rad | 161-0610 | |
| Ácido etilenglicol-bis(2-amin–etiléter)-N,N,N′,N′-tetraacético (EGTA) | Sigma-Aldrich | E-4378 | |
| Microesferas biotiniladas FluoSpheres, 40 nm, fluorescentes amarillo-verdosas (505/515) | Invitrogen | F-8766 | |
| Oxidasa de glucosa | Sigma-Aldrich | G-7016 | |
| Guanosina-5’-trifosfato (GTP) | Roche Group | 106399 | |
| Cloruro de magnesio (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 63069 | |
| Paclitaxel (Taxol) | Sigma-Aldrich | T1912 | |
| Ácido piperazina-1,4-di(etanosulfónico), piperazina-1,4-bis(2-etanosulfónico), piperazina-N,N′-bis(2-etanosulfónico) (PIPES) | Sigma-Aldrich | P-6757 | |
| Hidróxido de potasio (KOH) | Sigma-Aldrich | P-6310 | |
| Hidróxido de sodio (NaOH) | Sigma-Aldrich | 480878 | |
| Conjugado de estreptavidina Alexa Fluor 568 | Invitrogen | S11226 |
Referencias
- Agarwal, A., Hess, H. Biomolecular motors at the intersection of nanotechnology and polymer science. Progress in Polymer Science. 35 (1-2), 252-252 (2010).
- Howard, J., Hunt, A. J., Baek, S. Assay of microtubule movement driven by single kinesin molecules.<....
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Reimpresiones y permisos
