Generación de esferoides a partir de líneas celulares: un método de cultivo celular tridimensional (3D)

Resumen

Fuente: Dillard, P., et al. A Ensayo de eliminación de esferoides por células CAR-T. J. Vis. Exp. (2018).

Los esferoides son un tipo de modelo de cultivo celular en 3D que se utiliza para representar con mayor precisión el entorno de una célula en comparación con los modelos monocapa de cultivo celular en 2D. En el protocolo de ejemplo, veremos a los científicos generar esferoides a partir de una línea celular de cáncer colorrectal y aplicar imágenes de células vivas para rastrear el crecimiento de los esferoides.

Protocolo

1. Generación de esferoides a partir de una línea celular de cáncer colorrectal

1. Lave las monocapas celulares HCT 116 (transducidas de forma estable para expresar el grupo de diferenciación 19 (CD19) y la proteína de fluorescencia verde (GFP)) con solución salina tamponada con fosfato (PBS; 5 mL para un matraz de 25^cm2 o 10 mL para un matraz de 75^cm2). Añadir tripsina (0,5 mL para un matraz de 25^cm2 o 1 mL para un matraz de 75^cm2) e incubar las células a 37 °C durante 5 min.
2. Verifique el desprendimiento celular bajo un microscopio y neutralice la enzima de disociación celular con medio Roswell Park Memorial Institute 160 completo (RPMI 1640) (RPMI 1640 + 10% FCS + Gentamicina; 10 mL para un matraz de 25^cm2 o 20 mL para un matraz de 75^cm2).
3. Suspensión de la célula centrífuga a 500 x g durante 5 min. Eliminar el sobrenadante con una pipeta y volver a suspender pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces con 5 mL de medio RPM1 1640 completo.
4. Cuente las células mediante la exclusión de azul de tripano en un contador de células compatible.
5. Centrifugar la suspensión de la célula a 500 x g durante 5 min. Eliminar el sobrenadante con una pipeta y volver a suspender en medio RPMI para obtener 5 x 10³células/mL.
6. Cubra una placa inferior redonda de 96 pocillos con 100 μL/pocillo de 100 μg/ml de poli-L-lisina (PLL) en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente. Lavar dos veces con PBS y dejar que la placa se seque.
7. Transfiera la suspensión celular a un depósito estéril y dispense 200 μL/pocillo en las placas inferiores redondas de 96 pocillos recubiertas de PLL utilizando una pipeta multicanal.
8. Transfiera la placa al aparato de imagen automatizado dentro de una incubadora (37 °C, 5% CO₂, 95% humedad).
9. Inicie sesión en el software de adquisición, seleccione Programar para adquirir | Lanzar Agregar embarcación | Escanear a tiempo | Crear embarcación: Nuevo.
10. Seleccione Tipo de escaneo: Esferoide. Seleccione los canales de interés: Fase + Campo claro (para seguir el crecimiento de los esferoides), Verde (para seguir la señal del tumor, tiempo de adquisición 300 ms) y Rojo (para seguir la apoptosis, tiempo de adquisición 400 ms).
    1. Seleccione el aumento deseado: 10x.
    2. Elija el modelo de placa y su posición en el cajón. Seleccione la posición de los pocillos para obtener una imagen. Introduzca la descripción del experimento: nombre, tipo de células, número de células.
11. Para la configuración del análisis, seleccione Aplazar el análisis hasta más tarde. Haga clic con el botón derecho en la línea de tiempo y seleccione la opción Establecer intervalo de grupo de escaneo seleccionadoy configure Agregar escaneos cada 4 h y Para un total de 24 h. Establezca la hora de inicio deseada (al menos 1 h después de la incubación en el aparato de imagen automatizado).
12. Verifique cada 2 días el crecimiento de esferoides iniciando sesión en el software de imágenes.
    1. Elija la opción Ver análisis recientes y haga doble clic en el experimento deseado. Seleccione Campo claro en el panel de canales de imagen y, a continuación, utilice la herramienta Medir entidades de imagen para medir el diámetro de los esferoides. Un esferoide tarda 6 días en alcanzar el tamaño deseado: 0,5 mm de diámetro. Agregue 50 μL de medio RPMI completo por pocillo en el día 4 para limitar el efecto de evaporación del medio.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco	SIGMA-ALDRICH	D8537-500ML	Número de Lote: RNBG7037
75 cm² de frascos de área de crecimiento	VWR	430639	Número de lote: 2218002
75 cm² de frascos de área de crecimiento	VWR	734-2705	Número de lote: 3718006
Trypsin-EDTA	SIGM-ALDRICH	T3924-100ml	Número de lote: SLBTO777
RPMI 1640 med L-glutamina, 10 x 500 mL	Tecnología de la vida (Gibco)	21875-091	Número de lote: 1926384
Gentamicin	Termo Fischer	15750060	Número de lote: 1904924A
Solución de Azul de Tripano, 0.4%	Termo Fischer	15250061	Número de lote: 1886513
96 placa de pozo, fondo redondo	VWR	734-1797	Número de lote: 33117036
X-VIVO 15 con Gentamicina L-Gln, Rojo Fenol, 1 L	BioNordika	BE02-060Q	Número de lote: 8MB036
Depósito de reactivos	VWR	89094-672	Número de lote: 89094-672
15 mL tubos	VWR	734-1867	Número de lote: 19317044
Suero fetal bovino	Gibco	10500064	Número de lote: 08Q3066K
HCT 116 Línea de Carcinoma Colorrectal	ATCC	CCL-247	-
Incucyte S3	Essen Bioscience