Generación de esferoides a partir de líneas celulares: un método de cultivo celular tridimensional (3D)

1. Generación de esferoides a partir de una línea celular de cáncer colorrectal

1. Lave las monocapas celulares HCT 116 (transducidas de forma estable para expresar el grupo de diferenciación 19 (CD19) y la proteína de fluorescencia verde (GFP)) con solución salina tamponada con fosfato (PBS; 5 mL para un matraz de 25^cm2 o 10 mL para un matraz de 75^cm2). Añadir tripsina (0,5 mL para un matraz de 25^cm2 o 1 mL para un matraz de 75^cm2) e incubar las células a 37 °C durante 5 min.
2. Verifique el desprendimiento celular bajo un microscopio y neutralice la enzima de disociación celular con medio Roswell Park Memorial Institute 160 completo (RPMI 1640) (RPMI 1640 + 10% FCS + Gentamicina; 10 mL para un matraz de 25^cm2 o 20 mL para un matraz de 75^cm2).
3. Suspensión de la célula centrífuga a 500 x g durante 5 min. Eliminar el sobrenadante con una pipeta y volver a suspender pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces con 5 mL de medio RPM1 1640 completo.
4. Cuente las células mediante la exclusión de azul de tripano en un contador de células compatible.
5. Centrifugar la suspensión de la célula a 500 x g durante 5 min. Eliminar el sobrenadante con una pipeta y volver a suspender en medio RPMI para obtener 5 x 10³células/mL.
6. Cubra una placa inferior redonda de 96 pocillos con 100 μL/pocillo de 100 μg/ml de poli-L-lisina (PLL) en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente. Lavar dos veces con PBS y dejar que la placa se seque.
7. Transfiera la suspensión celular a un depósito estéril y dispense 200 μL/pocillo en las placas inferiores redondas de 96 pocillos recubiertas de PLL utilizando una pipeta multicanal.
8. Transfiera la placa al aparato de imagen automatizado dentro de una incubadora (37 °C, 5% CO₂, 95% humedad).
9. Inicie sesión en el software de adquisición, seleccione Programar para adquirir | Lanzar Agregar embarcación | Escanear a tiempo | Crear embarcación: Nuevo.
10. Seleccione Tipo de escaneo: Esferoide. Seleccione los canales de interés: Fase + Campo claro (para seguir el crecimiento de los esferoides), Verde (para seguir la señal del tumor, tiempo de adquisición 300 ms) y Rojo (para seguir la apoptosis, tiempo de adquisición 400 ms).
    1. Seleccione el aumento deseado: 10x.
    2. Elija el modelo de placa y su posición en el cajón. Seleccione la posición de los pocillos para obtener una imagen. Introduzca la descripción del experimento: nombre, tipo de células, número de células.
11. Para la configuración del análisis, seleccione Aplazar el análisis hasta más tarde. Haga clic con el botón derecho en la línea de tiempo y seleccione la opción Establecer intervalo de grupo de escaneo seleccionadoy configure Agregar escaneos cada 4 h y Para un total de 24 h. Establezca la hora de inicio deseada (al menos 1 h después de la incubación en el aparato de imagen automatizado).
12. Verifique cada 2 días el crecimiento de esferoides iniciando sesión en el software de imágenes.
    1. Elija la opción Ver análisis recientes y haga doble clic en el experimento deseado. Seleccione Campo claro en el panel de canales de imagen y, a continuación, utilice la herramienta Medir entidades de imagen para medir el diámetro de los esferoides. Un esferoide tarda 6 días en alcanzar el tamaño deseado: 0,5 mm de diámetro. Agregue 50 μL de medio RPMI completo por pocillo en el día 4 para limitar el efecto de evaporación del medio.