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Abstract

Fuente: Koemans, T. S., et al. El condicionamiento del cortejo de Drosophila como medida del aprendizaje y la memoria. J. Vis. Exp. (2017).

Este video describe un ensayo de condicionamiento clásico que evalúa el aprendizaje y la memoria en Drosophila, llamado condicionamiento de cortejo. El ensayo se basa en la reducción del cortejo de los machos después de experimentar un rechazo por parte de una hembra preapareada no receptiva. El protocolo de ejemplo muestra una configuración para el procedimiento que se puede utilizar para evaluar la memoria a corto y largo plazo.

Protocol

Este protocolo es un extracto de Koemans et al., Drosophila Courtship Conditioning As a Measure of Learning and Memory, J. Vis. Exp. (2017).

NOTA: En el protocolo descrito a continuación, se describe una réplica de la recopilación, el entrenamiento y las pruebas. Con el fin de probar la reproducibilidad de los resultados, estos pasos deben repetirse en paralelo, en varios días y con grupos separados de moscas (Tabla 1). El protocolo se basa en un ciclo de vida de 10 días desde el huevo hasta el adulto, lo cual es normal cuando se crían moscas en condiciones constantes de 25 °C, 70% de humedad y un ciclo de luz/oscuridad de 12 h. Todos los aspectos de este protocolo asumen que las condiciones se mantienen constantes a lo largo de todo el ensayo. Las horas se indican como horas antes de que se enciendan las luces (BLO) o después de que se enciendan las luces (ALO) en la incubadora, ya que esto se puede configurar convenientemente según la hora del día preferida del investigador. Utilice el gas_CO2 solo para la recolección inicial de moscas macho ingenuas y para la recolección de hembras preapareadas. Este protocolo para el condicionamiento del cortejo se compone de los siguientes pasos:

1. Establecimiento de cultivos de colección de hembras preapareadas
2. Establecimiento de cultivos para la recolección de sujetos de prueba masculinos
3. Preparación de bloques de viviendas
4. Establecimiento de viales de apareamiento para la producción de hembras preapareadas estandarizadas
5. Colección de sujetos de prueba masculinos
6. adiestramiento
7. ensayo
8. Análisis de datos de vídeo y estadísticas

1. Establecimiento de Culturas de Colección de Mujeres Preapareadas

1. Prepara comida energética. Hervir agar al 0,8% (p/v), 8% (p/v) de levadura, 2% (p/v) de extracto de levadura, 2% (p/v) de peptona, 3% (p/v) de sacarosa, 6% (p/v) de glucosa, 0,05% (p/v) de MgSO₄ y 0,05% (p/v) de CaCl₂ en agua durante 15 min. Deje que la solución se enfríe a 70 °C antes de añadir un 0,05% (p/v) de metilparabeno (PRECAUCIÓN: tóxico) y un 0,5% (v/v) de ácido propiónico (PRECAUCIÓN: tóxico). Mezclar bien agitando mientras se enfría aún más a 50 °C para obtener una solución homogénea.
2. Antes de que el alimento se solidifique a temperatura ambiente, agregue ~ 50 mL de powerfood a cada vial de plástico de 175 mL. Deje que la comida se enfríe más. Cierre el vial con un tapón.
   NOTA: Powerfood es una mezcla de alimentos especializada formulada específicamente para la producción de un gran número de moscas, presumiblemente mediante la inducción de la puesta de huevos. Powerfood no se utiliza para producir moscas macho que se utilizarán para el análisis del comportamiento (paso 2) porque la dieta atípica y el posible hacinamiento podrían influir en el desarrollo.
3. En el día -11 (Tabla 1), comience de 5 a 20 cultivos de tipo silvestre con aproximadamente 60 a 100 moscas (una mezcla de machos y hembras) en viales de alimento para energía; estos se utilizarán en el paso 4 para producir hembras preapareadas estandarizadas. Agregue un papel de filtro a cada vial para aumentar el área en la que las larvas pueden pupar; Esto aumentará el número de moscas que pueden cerrarse.
4. Repita periódicamente los pasos 1.1-1.3 a lo largo del experimento para obtener suficientes moscas recién cerradas como entrada para el “establecimiento de viales de apareamiento para la producción de hembras preapareadas estandarizadas” (paso 4).

2. Establecimiento de cultivos para la recolección de sujetos de prueba masculinos

1. Prepare alimentos normales, hechos con 0,5% (p/v) de agar, 2,75% (p/v) de levadura, 5,2% (p/v) de harina de maíz, 11% (p/v) de azúcar, 0,05% (p/v) de metilparabeno y 0,5% (v/v) de ácido propiónico en agua, como se describe en los pasos 1.1 y 1.2. Cierre los viales de plástico de 175 ml con un tapón para viales antimoscas.
2. En el día -10 (Tabla 1), coloque alrededor de 10-20 machos con aproximadamente 30-75 hembras vírgenes (Tabla de Materiales/Equipo) en cada vial de 175 mL que contenga alimento normal. Agregue un papel de filtro para aumentar el área de superficie para la pupación y maximizar la productividad.
3. Establecer de tres a seis viales de 175 mL por genotipo para obtener el número requerido de machos sujetos de prueba.
   NOTA: Es posible que se necesiten más viales, dependiendo de la productividad del genotipo deseado.

3. Preparación de bloques de vivienda (Figura 2A)

1. Derrita aproximadamente 50 ml de powerfood por bloque de carcasa en un microondas o prepárelo fresco.
2. Añada 500 μl de powerfood a cada pocillo de un bloque de fondo plano de 96 pocillos utilizando una pipeta multidispensadora.
3. Deje que la comida se solidifique a temperatura ambiente.
4. Cubra los bloques con una película adhesiva PCR y use una aguja para hacer al menos 4 agujeros por pocillo para proporcionar aire fresco a las moscas.
5. Para poder abrir cada pozo, use una cuchilla de afeitar para cortar la película adhesiva a lo largo entre cada fila. Deja la película intacta en un extremo del bloque.
6. Los bloques pueden almacenarse a 4 °C durante un máximo de 2 días.
   NOTA: Deje que los bloques se reequilibren a temperatura ambiente antes de usarlos.

4. Establecimiento de viales de apareamiento para la producción de hembras preapareadas estandarizadas

1. En el día -1, retire y deseche todas las moscas adultas de tipo silvestre de los cultivos de colección de hembras preapareadas a las 2-5 h BLO.
2. Recoja las moscas usando el aspirador (Figura 2B) de estos viales en intervalos de 2 a 3 horas (por ejemplo, a 30 min, 2.5 h y 5 h ALO) y colóquelas en un nuevo vial de powerfood complementado con una pequeña cantidad de pasta de levadura y papel de filtro.
3. Para evitar aglomeraciones y promover una atmósfera de apareamiento óptima, no transfiera más de 150-200 moscas a cada nuevo vial. Asegurar el apareamiento de todas las hembras proporcionando al menos un 25% de machos. Asegúrese de que haya suficientes hembras en los viales de apareamiento para acomodar el tamaño del experimento.
   NOTA: Como este es un paso crucial en el protocolo, asegúrese de que solo las moscas recién cerradas y no las moscas, larvas o pupas viejas se transfieran al nuevo vial de apareamiento.
4. Incubar estos “viales de apareamiento” durante cuatro días para dar tiempo suficiente a que todas las hembras se hayan apareado.

5. Colección de sujetos de prueba masculinos

1. El día 1 (Tabla 1) a las 2-3 h de blob, use CO₂ para eliminar todas las moscas adultas de los viales de recolección de machos (paso 2), pero deje que se acerquen más moscas durante las próximas horas.
2. Durante las siguientes 5-6 h, retire las moscas recién cerradas cada 20-30 minutos con CO₂ y coloque cada macho en un pozo individual del bloque de alojamiento (paso 3) usando el aspirador (Figura 2B).
3. Vuelva a sellar el pocillo con la película adhesiva PCR.
   NOTA: Este es un paso crucial en el protocolo. Los machos deben recogerse con frecuencia. Los machos recolectados deben aislarse en el bloque de alojamiento cerca del momento de la eclosión, cuando muestran pigmentación pálida y la presencia del meconio en el abdomen translúcido.
   NOTA: El uso suave del aspirador permite la transferencia de moscas; sin embargo, el uso inadecuado estresará a las moscas, causando variaciones en el ensayo (consulte la Discusión).
4. El objetivo es recolectar hasta 48 machos por genotipo. Esto proporciona un pequeño exceso del número máximo de machos necesarios para el análisis de las condiciones tanto ingenuas como entrenadas, lo que permite algunas pérdidas durante los pasos posteriores de la transferencia.

6. Entrenamiento

1. Retire las moscas del vial de apareamiento (paso 4.2) con CO₂ y separe las hembras preapareadas de los machos.
2. Usando el aspirador, agregue una sola hembra anestesiada y preapareada a cada pocillo en una fila de un nuevo bloque de viviendas.
3. Utilizando el aspirador y sin anestesia, transfiera un macho ingenuo individual desde el bloque de viviendas establecido en el paso 5.2 hasta el pozo que contiene una hembra preapareada. Después de colocar el macho en el pocillo, vuelva a sellar inmediatamente con la película adhesiva; No permita que el macho escape.
   NOTA: Transfiera las moscas macho del aspirador al bloque de viviendas aprovechando su comportamiento natural de “geotaxis negativa”.
4. Repita los pasos 6.2-6.3 hasta que se establezcan suficientes parejas macho-hembra. Lo ideal es establecer 24 parejas, dos filas completas de un bloque de vivienda, por genotipo. Deje a los machos ingenuos restantes en el bloque de viviendas original establecido en el paso 5.2.
5. Deje a las parejas macho-hembra intactas durante el período de entrenamiento (Tabla 2, Figura 1B).
   NOTA: Durante este tiempo, el macho cortejará y será rechazado por la hembra preapareada. Para el aprendizaje y STM, el período de formación es de 1 h y para LTM, el período de formación es de 7-9 h.
6. Finalice el entrenamiento (Tabla 2, Figura 1B) utilizando un aspirador para separar suavemente al macho de la hembra preapareada; no utilice anestesia. Coloque al macho separado en un nuevo bloque de viviendas.
7. Utilice el aspirador para transferir a todos los hombres ingenuos suavemente y sin anestesia desde el bloque de viviendas establecido en el paso 5.2 a un nuevo bloque de viviendas.
   NOTA: Este paso es opcional para STM y aprendizaje, pero es muy importante para LTM porque las moscas se alojan durante 24 horas adicionales para probar LTM.
8. Para STM y LTM, deje que los machos descansen durante 1 h y ~ 24 h, respectivamente (Tabla 2, Figura 1B) antes de la prueba (paso 7).
9. Para el aprendizaje, pruebe inmediatamente a los machos entrenados e ingenuos (paso 7).

7. Pruebas

1. Recoja las moscas de los viales de apareamiento (paso 4.2) usando CO₂ y separe las hembras preapareadas de los machos.
2. Deje que las hembras se recuperen de la anestesia durante al menos 1 h en un vial que contenga alimento normal.
3. Monte las grabadoras de video con anticipación (Figura 2C), para tener todo el equipo listo antes de que comience la prueba.
4. Inicie la prueba de acuerdo con las diferentes líneas de tiempo para el aprendizaje, STM y LTM (Tabla 2, Figura 1B). Realice pruebas inmediatamente después del entrenamiento para el aprendizaje, 1 h después del entrenamiento para STM y 24 h después del entrenamiento para LTM.
5. Usando el aspirador, transfiera suavemente a un macho individual desde el bloque de viviendas en reposo o desde el bloque de viviendas de entrenamiento si se está probando el aprendizaje (paso 6.7, entrenado; paso 6.8, ingenuo) a la mitad de una arena de cortejo con el divisor cerrado (Figura 2D; ver Archivo S1 para un plano de construcción).
   NOTA: El uso del comportamiento natural de “geotaxis negativa” debería ser suficiente para transferir las moscas macho del aspirador al campo de cortejo.
6. Mueva rápida pero suavemente el orificio de entrada a la siguiente arena y repita el paso 7.5 hasta que las 18 arenas contengan un macho.
7. Usando el aspirador y sin CO₂, agregue una hembra preapareada (recolectada en el paso 7.2) a la otra mitad de las 18 arenas.
8. Coloque con cuidado la cámara de cortejo debajo de la cámara, con la abertura de los pozos hacia abajo (Figura 2C).
9. Retire el divisor de las arenas para permitir la interacción directa entre los machos y las hembras preapareadas.
10. Comience a registrar inmediatamente el comportamiento durante al menos 10 min.
    NOTA: Cuando se utiliza una configuración de dos cámaras, la grabación paralela de dos placas de cortejo se puede realizar en marcos de tiempo superpuestos para maximizar la eficiencia.
11. Vacíe las arenas de cortejo con una aspiradora de mano y permita que la cámara de cortejo se ventile antes de volver a usarla.
12. Repita los pasos 7.4-7.11 hasta que se hayan completado las pruebas de todos los genotipos y condiciones (es decir, ingenuos y entrenados).

8. Análisis de datos de video y estadísticas

1. Calcule el índice de cortejo (IC), definido como el porcentaje de tiempo que el macho corteja durante los primeros 10 minutos del período de prueba, para cada mosca macho individual><. NOTA: Esto se puede hacer manualmente observando el comportamiento estereotipado del cortejo (Figura 1A) o utilizando software informático para la cuantificación automatizada del comportamiento del cortejo.
   NOTA: Se recomienda analizar de 40 a 60 hombres por condición en el transcurso de tres días para lograr suficiente poder estadístico y juzgar la consistencia de los datos de IC.
2. Calcular el índice de aprendizaje (LI), definido como la reducción porcentual en el IC medio de los hombres entrenados en comparación con los hombres ingenuos (LI = (IC_naïve – CI_entrenado) / CI_naïve). Evalúe el LI de cada día de prueba y compárelo con el LI acumulativo calculado a partir de todos los días de prueba combinados.
3. Cree un archivo de datos de tabulación separado de dos columnas con “Genotipo” y “CI” como encabezados.
   NOTA: Estos encabezados distinguen entre mayúsculas y minúsculas. El nombre del genotipo para cada IC debe consistir en una descripción del genotipo seguida de un guión bajo y la condición de entrenamiento (por ejemplo, genotype_N y genotype_LTM, etc., donde N = ingenuo y LTM = memoria a largo plazo; ver Archivo Suplementario S2 para un ejemplo). Esta anotación es esencial, ya que la función analearn identificará las moscas entrenadas e ingenuas en función de los caracteres presentes después del primer guión bajo en la columna “Genotipo”.
4. Utilice el script analearn R (Archivo Suplementario S3) para realizar una prueba de aleatorización para juzgar la significación estadística de las diferencias entre los valores de LI de diferentes genotipos.
   1. Introduzca el script (Archivo suplementario S3) en R, que define una función llamada “analearn”.
      NOTA: La definición de la función es: analearn <- function(nboot = 10,000, naivelevel = 'N', refmutation = NA, datname = NA, header = TRUE, seed = NA, writeoutput = TRUE).
   2. Inicie la función introduciendo “analearn()” en la línea de comandos de R y seleccionando el archivo de datos a analizar (producido en el paso 8.3) a través de la ventana emergente.
   3. Elija la mutación de referencia, que es el genotipo de control, introduciendo el número correspondiente y pulsando enter.
      NOTA: Después de seleccionar el genotipo de referencia, el script tarda varios segundos en realizar 10.000 réplicas de arranque.
   4. Obsérvese la tabla de salida (Tabla 3), que contiene el genotipo, la condición de aprendizaje (es decir, aprendizaje, STM o LTM), la media de CI naïve, la media de CI entrenado, LI, la diferencia entre el LI del control en comparación con la condición experimental (LI dif), el límite inferior (LL) y el límite superior (UL) del intervalo de confianza del 95% del LI dif, y el valor p que indica la probabilidad de que no haya diferencia significativa.
      NOTA: analearn almacenará un archivo de texto de salida en el directorio donde se encuentra el archivo de datos. Sin embargo, la tabla de salida también aparece en la consola de R-Studio. El nombre predeterminado se construye en función del nombre del archivo de datos proporcionado.
   5. Hay varios argumentos en la función analearn que se pueden usar para alterar la configuración predeterminada de la función para ajustar los parámetros de bootstrapping.
      NOTA: “nboot” define el número de réplicas de bootstrap y se establece en 10,000 de forma predeterminada. Este valor se puede cambiar a cualquier número entero mayor que cero. En la tabla 5 se enumeran varios argumentos que se pueden utilizar para modificar la configuración predeterminada de la función. Sin embargo, no se recomienda utilizar datos que se generen con un número bajo de réplicas de arranque.

Representative Results

Materials

<em>P{KK101437}VIE-260B</em>	VDRC	101437	Dhat-at-RNAi in 60100 background
<em>P{KK108109}VIE-260B</em>	–	–	Control-RNAi in 60100 background (gift from K. Keleman)
<em>w+, UAS-dcr2/yhh;;elav-Gal4 (III)</em>	–	–	panneuronal driver line
Containers for plant tissue culture	VWR	960177	175 mL plastic vials
Folded filters	Whatman	10311643	Filter paper to enlarge area flies can pupate on
Flat-bottom blocks (96-wells)	Qiagen	19579	Used for housing blocks
MicroAmp Clear Adhesive Film	Applied Biosystems	4306311	PCR adhesive film as lid on flat-bottom blocks
Razor blade	–	–	Any sharp will do
Needle	–	–	0.8 mm diameter
Aspirator	–	–	Cut a 1mL pipet tip with scissors in order to have two pieces. The narrow tip of the pipettip is placed as fly entrance in a ~80 cm flexible hose. To prevent a fly from getting in the hose, a normal piece of cotton or small mesh gaze is placed in between the tip and the hose. The other half of the pipettip can be used as mouth piece at the end of the hose.
Courtship chambers	–	–	file S1 can be opened with indicated CAD software
Camcorder	Sony	–	camera specification: >4M pixels, full HD.
For manual quantification, any simple video recording device has the potential to produce a video of sufficient quality to observe courtship behavior accurately. For automated quantification, there will likely be different requirements depending on the software to be used, and users should investigate this thoroughly if automated quantification is desired.
<strong>Name</strong>	<strong>Company</strong>	<strong>Catalog Number</strong>	<strong>Comments</strong>
power food
Agar	Sigma	A7002
Yeast	Bruggeman	–
Yeast extract	MP biomedicals	0210330391
Peptone	Sigma	P6838
Sucrose	Sigma	S9378
Glucose	Sigma	G7021
MgSO4	Sigma	M2643
CaCl2	Merck	1023780500
Methylparabene (CAUTION)	Sigma	H5501
Propionic acid (CAUTION)	Sigma	P1386
Demineralized water	–
Yeast paste	–		yeast grains and water mixture in a 1:1 ratio
Name	Company	Catalog Number	Comments
normal food
Agar	MP biomedicals	215017890
Yeast	bruggeman	–
Corn flour	de Molen	–
Sugar	de Molen	–
Methylparabene (CAUTION)	Sigma	H5501
Propionic acid (CAUTION)	Sigma	P1386
Demineralized water	–