Este protocolo es un extracto de Qiang et al., A Burrowing/Tunneling Assay for Detection of Hypoxia in Drosophila melanogaster Larvae, J. Vis. Exp. (2018).
1. Preparación de larvas
- Dos o más días antes de comenzar el ensayo, se colocaron cruces de las combinaciones experimentales y de control deseadas (mínimo 20 hembras y 10 machos cada una) en placas de puesta de huevos según lo descrito por Wieschaus y Nusslein-Volhard, pero utilizando vasos de precipitados de polipropileno de 50 mL y placas de Petri desechables de 6,0 cm que contenían agar uva y se untaron con pasta de levadura justo antes de su uso. Mantenga las moscas en platos de puesta de huevos en la oscuridad a temperatura ambiente hasta que las necesite.
- Receta de agar uva: combine 100 ml de concentrado de jugo de uva 100% congelado, 350 ml de agua desyoinizada, 5 ml de acético glacial y 13 g de agar D. melanogaster en un vaso de precipitados de vidrio de 1 l. Cocine en el microondas en ráfagas de 1-2 minutos, revolviendo entre ráfagas, hasta que el agar se disuelva por completo. Enfríe la solución durante unos minutos y luego agregue 10 mL de 10% (p/v) de Nipagen (metil-p-hidroxibenzoato) en etanol al 95%. Mezclar, luego pipetear 7 mL por placa en placas de Petri desechables de 6,0 cm, dejar gelificar y secar a temperatura ambiente durante 3-4 h. Almacenar a 4 °C en bolsas de plástico.
- Receta de pasta de levadura: 7 g de levadura seca, 10 ml de agua desionizada, mezclar con una espátula hasta obtener una consistencia uniforme.
- Recolección de huevos cronometrada para generar larvas experimentales y de control. Usando platos de uva nuevos untados con levadura, recoja los huevos a temperatura ambiente durante 4 h en la oscuridad durante las horas de la mañana. Retire estas placas de recolección de 4 h y reemplácelas con placas nuevas. Incubar las placas de recolección de 4 h durante la noche a 25 °C hasta la tarde del día siguiente, cuando la mayoría de las larvas habrán eclosionado. Recoge estas larvas de primer estadio y utilízalas para preparar el experimento.
>2. Configuración de las placas de ensayo
- Preparación de placas de ensayo. Para una sola ejecución del ensayo, prepare cinco placas de ensayo de 10 larvas experimentales y cinco placas de 10 larvas de control. Utilice un barrenador de corcho de 1,5 cm para quitar un núcleo central de agar de cada plato creando un agujero para la comida. Coloque pasta de levadura (0,8 - 0,9 g) en el agujero y golpee suavemente con una espátula para hacer un montículo que llene el agujero.
- Preparación de la placa de agar: combine 700 ml de agua desionizada con 16 g de agar D. melanogaster en un vaso de precipitados de vidrio de 2 litros y cocine en el microondas durante 5 min. Retire del microondas y revuelva con una varilla de vidrio para incorporar el agar no disuelto a la solución. Agregue 17.5 mL de Nipagen al 10% (p/v) en etanol al 95%, mezcle, luego continúe calentando en microondas en ráfagas de 30 s seguidas de agitación, hasta que todo el agar se disuelva por completo. Deje enfriar durante uno o dos minutos, luego pipetee 15 ml de alícuotas en placas de Petri de plástico de 10 cm. Deje que el agar se gelifique, cubra las placas con tapas y déjelas secar a temperatura ambiente durante unas horas o toda la noche. Guarde los platos en bolsas de plástico selladas a 18 °C.
NOTA 1: Para evitar la formación de cristales de Nipagen en la superficie de las placas debido a un exceso de desecación, use las placas a los pocos días de la preparación. Si es necesario, los cristales se pueden volver a disolver dejando caer sobre ellos unos microlitros de alcohol al 95%.
NOTA 2: los lotes de agar pueden tener diferentes propiedades gelificantes. Las placas de gel seco deben ser firmes al tacto y lo suficientemente resistentes como para que se pueda eliminar un círculo limpio e intacto de agar cuando se use el barrenador de corcho para crear el agujero de comida (ver arriba).
- Colocación de larvas en placas de ensayo. Use presión mecánica para curvar la punta de una microespátula de plástico y sumerja la punta en pasta de levadura para proporcionar "adhesivo" para recoger las larvas. Recoja las larvas del primer estadio individualmente y colóquelas en la placa de agar cerca del montículo de comida. Prepare al menos cinco placas replicadas de 10 larvas para genotipos experimentales y de control. Una vez completado, tape y etiquete cada plato y coloque los platos (con la tapa hacia arriba) en un espacio oscuro a temperatura ambiente (en nuestro laboratorio esto es de 22 ° C).
>3. Monitorización de placas de ensayo
- Examine las placas diariamente bajo un microscopio de disección y registre el número de larvas en la parte superior de la comida o en la superficie del agar. Fíjate en las larvas muertas o moribundas visibles. Obsérvese cuándo, y si, se observa un túnel en el sustrato de agar a medida que las larvas se mueven hacia el tercer estadio. Anote las fechas en las que comienzan a formarse las pupas y anote cualquier anomalía de la pupa. Continúe las observaciones diarias hasta que todas las larvas hayan muerto o pupado.
- Retire las pupas con cuidado del plato con una aguja de burla doblada y transfiéralas a un plato de uva. Si lo desea, continúe monitoreando las pupas para determinar cuántas se encierran como adultas.
