Drosophila Disección del disco imaginal de las larvas: un método para observar el desarrollo de los epitelios

Resumen

Fuente: Morimoto, K. y Tamori, Y. Inducción y diagnóstico de tumores en el epitelio del disco imaginal de Drosophila. J. Vis. Exp. (2017).

Al teñir discos imaginales de Drosophila, a menudo se realiza una disección aproximada en la que los discos quedan expuestos pero permanecen unidos al cuerpo. Una vez teñidos, los discos de interés se aíslan y se montan. El protocolo de ejemplo muestra un procedimiento para la disección y el montaje del disco imaginal del ala.

Protocolo

Este protocolo es un extracto de Morimoto y Tamori, Inducción y diagnóstico de tumores en el epitelio del disco imaginal de Drosophila, J. Vis. Exp. (2017).

1. Disección de larvas

1. Recoja las larvas errantes del tercer estadio con un palo de madera o pinzas romas, las genotipee con marcadores fluorescentes apropiados (por ejemplo, EGFP) bajo un microscopio estereoscópico de fluorescencia y colóquelas en una placa de disección con PBS (solución salina tamponada con fosfato).
2. Lavar las larvas en PBS pipeteando con pipetas de transferencia de plástico de 2 mL.
3. Pellizca el centro de la larva con una pinza y rompe el cuerpo por la mitad con las otras pinzas.
4. Pellizque el gancho de la boca de la mitad anterior con una pinza y empuje la boca hacia el cuerpo con las otras pinzas para darle la vuelta al cuerpo.
5. Retire los materiales innecesarios, como las glándulas salivales o los cuerpos grasos, con pinzas.

>2. Fijación y tinción de anticuerpos

1. Transfiera la mitad anterior disecada del cuerpo larvario (incluidos los discos imaginales de las alas) a un tubo de plástico de 1,5 mL y fíjela en 1 mL de solución Fix (4% de formaldehído en PBS) durante 10 min a temperatura ambiente en la oscuridad con una rotación suave
   cautela: El formaldehído es tóxico y tiene potencial cancerígeno. Use guantes y ropa protectora para evitar el contacto con la piel.
   NOTA: En esta parte, todos los pasos se llevan a cabo en un nutator a temperatura ambiente en la oscuridad, a menos que se indique lo contrario.
2. Retire la solución Fix y deséchela. Lave los pañuelos con 1 mL de PBT (0.3% Triton X-100 en PBS) tres veces durante 15 minutos cada uno.
3. Retirar el PBT y añadir 1 mL de PBTG (0,2% de albúmina sérica bovina y 5% de suero normal de cabra en PBT) para el bloqueo y nutato 1 h a temperatura ambiente o toda la noche a 4 °C.
4. Retirar el PBTG y añadir la solución de anticuerpos primarios adecuadamente diluida con PBTG (ver Tabla de Materiales) y nutato durante la noche a 4 °C.
5. Retire la solución de anticuerpos primarios y lave los pañuelos con 1 mL de PBT tres veces durante 15 minutos cada uno.
6. Retire el PBT y añada la solución de anticuerpos secundarios diluida adecuadamente con PBTG (1:400). Nutato durante 2 h a temperatura ambiente o toda la noche a 4 °C.
7. Retire la solución de anticuerpos secundarios y lave los tejidos con 1 ml de PBT dos veces durante 15 minutos cada una.
8. Para teñir la F-actina, retire el PBT y añada la solución de faloidina adecuadamente diluida en PBS (1:40). Luego nutate durante 20 min. Retire la solución de faloidina y lave los pañuelos con 1 ml de PBT dos veces durante 15 minutos cada una.
9. Para contrarrestar la tinción del ADN nuclear, elimine el PBT y agregue la solución de DAPI (4', 6-diamidino-2-fenilindol) (0,5 μg/mL de DAPI en PBS). Luego nutate 10 min.
   cautela: DAPI tiene potencial cancerígeno. Use guantes y ropa protectora para evitar el contacto con la piel.
10. Retire la solución de DAPI y lave los pañuelos con 1 mL de PBT dos veces durante 15 minutos cada una.
11. Enjuague una vez en 1 ml de PBS durante 10 minutos a temperatura ambiente.
12. Retire el PBS y añada 500 μL de glicerol al 100 % como medio de premontaje.

>3. Montaje en portaobjetos de microscopio

1. Coloque los tejidos teñidos en un portaobjetos de microscopio utilizando una pipeta de transferencia de plástico de 2 mL.
2. Transfiera los tejidos a gotas de medio de montaje en otro portaobjetos de microscopio con pinzas.
3. Sujete el extremo del tejido diseccionado con una pinza y retire los discos de las antenas del cerebro y del ojo con las otras pinzas><. NOTA: Guarde los cerebros disecados para colocarlos cerca de los discos imaginales de las alas. Los cerebros actúan como una plataforma, evitando que el cubreobjetos aplaste los discos imaginarios de las alas.
4. Para aislar los discos imaginales del ala><, sujetan el extremo del tejido disecado con una pinza y rascan suavemente la pared del cuerpo y arrancan los discos con las otras pinzas. NOTA: Si es difícil encontrar los discos imaginales de las alas, pele la tráquea desde la parte posterior hasta la cara anterior. Los discos imaginales de las alas se adhieren a la tráquea.
5. Cubra suavemente los discos imaginales con un cubreobjetos y séllelos con esmalte de uñas; almacene a 4 °C.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Reactivos
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)	Wako	162-19321
TritonX-100	Wako	De los 168 a 11805
Formaldehído	Wako	064-00406
albúmina sérica bovina	sigma	A7906
Suero de cabra normal	sigma	G6767
medio de montaje, Vectashield	Laboratorios de vectores	H-1000
DAPI	sigma	D9542
ratón-anti-Dlg 4F3	Banco de Hibridomas de Estudios del Desarrollo	4F3 anti-discos grandes, RRID:AB_528203	diluir en PBTG, 1:40
ratón-anti-MMP1	Banco de Hibridomas de Estudios del Desarrollo	3A6B4, RRID:AB_579780	3 mezclados 1:1:1 y diluidos en PBTG, 1:40
ratón-anti-MMP1	Banco de Hibridomas de Estudios del Desarrollo	3B8D12, RRID:AB_579781	3 mezclados 1:1:1 y diluidos en PBTG, 1:40
ratón-anti-MMP1	Banco de Hibridomas de Estudios del Desarrollo	5H7B11, RRID:AB_579779	3 mezclados 1:1:1 y diluidos en PBTG, 1:40
ratón-anti-atubulina	Banco de Hibridomas de Estudios del Desarrollo	AA4.3, RRID:AB_579793	diluido en PBTG, 1:100
Alexa Fluor 546 Faloidina	Sondas moleculares	A22283	diluido en PBS, 1:40
anticuerpo IgG anti-ratón de cabra, Alexa Fluor 546	Sondas moleculares	A11030	diluido en PBTG, 1:400
Cepas de moscas
sd-Gal4	Centro de Acciones de Drosophila de Bloomington	#8609	recombinado con UAS-EGFP
upd-Gal4	Centro de Acciones de Drosophila de Bloomington	#26796	recombinado con UAS-EGFP
UAS-lgl-RNAi	Centro de ARNi de Drosophila en Viena	#51247
UAS-scrib-RNAi	Centro de ARNi de Drosophila en Viena	#105412
UAS-RasV12	Centro de Acciones de Drosophila de Bloomington	#64196
UAS-Yki3SA	Centro de Acciones de Drosophila de Bloomington	#28817
hsFLP	Centro de Acciones de Drosophila de Bloomington	#6
Act>CD2>GAL4 (GAL4 abatible)	Centro de Acciones de Drosophila de Bloomington	#4780	recombinado con UAS-EGFP
UAS-EGFP	Centro de Acciones de Drosophila de Bloomington	#5428	Cromosoma X
UAS-EGFP	Centro de Acciones de Drosophila de Bloomington	#6658	Tercer cromosoma
UAS-Dicer2	Centro de Acciones de Drosophila de Bloomington	#24650	Segundo cromosoma
UAS-Dicer2	Centro de Acciones de Drosophila de Bloomington	#24651	Tercer cromosoma
vkg-GFP	Morin et al. 2001		Trampa de proteínas GFP