Este protocolo es un extracto de Immarigeon et al., Un protocolo basado en FACS para aislar el ARN de las células secundarias de las glándulas accesorias masculinas de Drosophila, J. Vis. Exp. (2019).
1. Soluciones y preparación de materiales
- Prepare las siguientes soluciones.
- Medio suplementado de suero (SSM): Medio de Drosophila de Schneider complementado con un 10% de suero fetal bovino inactivado por calor y un 1% de penicilina-estreptomicina.
- Prepare alícuotas de 1x enzima de tripsina (por ejemplo, TrypLE Express Enzyme) y almacene a temperatura ambiente.
- Preparar alícuotas de papaína [50 U/mL] (almacenadas a -20 °C y descongeladas una sola vez).
- Prepare 1x solución salina tampón de fosfato (PBS, almacenado a temperatura ambiente).
- Prepare varias puntas de pipeta redondeadas a la llama para la disociación física de las glándulas accesorias.
NOTA: Utilice puntas de baja retención para manipular las glándulas accesorias, ya que tienden a adherirse al plástico sin tratar. El proceso de redondeo con llama reduce la apertura de la punta y suaviza los bordes de la punta. Esto asegura una disociación eficiente después de la digestión de la peptidasa sin cizallar las membranas celulares.
- Corta una punta de 200 μL con una cuchilla afilada y pásala suavemente sobre una llama para redondear su punta, de modo que la abertura sea más ancha pero suave para su manipulación durante el paso 2.7.
- Estreche la abertura de varias puntas de 1.000 μL pasando la abertura de la punta cerca de una llama durante menos de un segundo. Gire la punta ligeramente para evitar que se derrita demasiado o se obstruya. Ordena las puntas hechas de más estrechas a más anchas. Esto se puede hacer cronometrando la velocidad de aspiración. Intente disociar una muestra a pequeña escala de AG para probar la eficiencia de las puntas más estrechas.
NOTA: Estas puntas son críticas para la agitación mecánica. Las puntas de pipeta redondeadas por llama de calidad permiten una disociación completa al tiempo que preservan la viabilidad de la célula. Como tal, estas puntas se lavan a fondo con agua al final del procedimiento para su reutilización. Esto permite una disociación reproducible en el día a día.
2. Disección de glándulas accesorias
- Ponga de 20 a 25 Drosophila machos en un plato de vidrio con hielo.
- Diseccionar 1 macho en SSM. Retire su tracto reproductivo y limpie el par de glándulas accesorias de todos los demás tejidos, excepto del conducto eyaculatorio.
NOTA: Extirpa los testículos porque los espermatozoides liberados pueden crear grumos y perturbar el proceso de disociación. Retire el bulbo eyaculatorio, lo que dificulta su manejo cuando flota.
- Con pinzas, transfiera las glándulas accesorias a una placa de vidrio llena de SSM a temperatura ambiente. Repita los pasos 2.2-2.3 20 veces para obtener un lote de 20 pares de glándulas en SSM.
NOTA: Estos pasos se lograrán en 15 a 20 minutos. Los AG deben verse saludables y los movimientos peristálticos de la capa muscular alrededor de las glándulas deben ser visibles. La GFP se puede controlar con un microscopio fluorescente.
- Transfiera las glándulas accesorias a 1x PBS para un lavado de 1-2 minutos a temperatura ambiente.
NOTA: Para una mejor disociación, es imperativo enjuagar las glándulas con PBS. La duración de este paso, sin embargo, debe limitarse ya que las células muestran signos de estrés en PBS; las células secundarias disociadas en PBS se hinchan y mueren rápidamente.
- Diluya 20 μL de papaína [50 U/mL] en 180 μL de 1x enzima tripsina para obtener la solución de disociación (para aumentar o reducir la escala, mantenga 9 μL de enzima tripsina y 1 μL de papaína para cada macho). Con pinzas, transfiera las glándulas accesorias a esta solución.
- Aísle la punta de las glándulas accesorias (que contienen células secundarias) de la parte proximal. Use pinzas finas para pellizcar firmemente el centro de un lóbulo glandular y corte con la punta afilada de una segunda pinza. Extirpar la parte proximal de las glándulas accesorias y el conducto eyaculatorio para mejorar la disociación y reducir el tiempo de clasificación de las células.
NOTA: La disección de la parte distal de 20 pares de glándulas llevará de 15 a 20 minutos y, por lo tanto, la digestión por parte de las peptidasas comenzará a temperatura ambiente.
- Una vez que se hayan diseccionado todas las puntas de las glándulas, transfiéralas a un tubo de 1,5 ml utilizando una punta de pipeta especial de 200 μL preparada en el paso 1.2.1. Debe ser ancho, redondeado y húmedo antes de manipular las glándulas.
NOTA: Para pipetear el tejido de la glándula accesoria, las puntas siempre deben humedecerse previamente con una solución adecuada (enzima tripsina o SSM, mantenga un tubo de cada uno para este propósito). Enjuague cuidadosamente las puntas entre muestras para evitar la contaminación.