Drosophila melanogaster Disección de ovarios: una técnica para la preparación de tejidos ex vivo

En este artículo

Resumen

Fuente: Parker, D. J., et al. Estudio de la estructura y función mitocondrial en ovarios de Drosophila. J. Vis. Exp. (2017).

Este video describe la anatomía general del ovario de Drosophila y presenta un método de disección de ovarios para obtener imágenes vivas o fijas.

Protocolo

Este protocolo es un extracto de Parker et al., Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries, J. Vis. Exp. (2017).

1. Preparación de Drosophila (las herramientas necesarias se muestran en Figura 1A)

Para cualquiera de los experimentos descritos, recoja Drosophila (mantenida a temperatura ambiente o 25 °C) dentro de los 5 días posteriores a la eclosión y colóquela en un vial lleno de 5 a 7 mL de alimento para Drosophila (ver Tabla de Materiales), con no más de 25 moscas en cada vial; mantenga una proporción hembra:macho de 2:1.
Espolvorea una pequeña cantidad de levadura granulada para estimular la producción de huevos de Drosophila. Realizar la manipulación experimental en un plazo de 2 a 4 días.

2. Disección de ovarios de Drosophila (las herramientas necesarias se representan en Figura 1A)

Caliente el medio de disección de insectos (véase la Tabla de materiales) a temperatura ambiente, 25 °C. Llene tres pocillos de una placa de disección de vidrio de ocho pocillos, con 200 μL de medio en cada pocillo.
Anestesiar Drosophila con CO₂ colocando la aguja de la pistola de cerbatana debajo del tapón del vial. Colócalos en una almohadilla para moscas. Usando un microscopio de disección, clasifique 5 hembras y colóquelas en el primer pocillo del plato de disección. Manipule una Drosophila a la vez cuando realice microscopía en vivo.
Mientras mira a través del ocular del microscopio de disección, corte el tórax del abdomen con dos pares de pinzas. Con las pinzas, transfiera con cuidado el abdomen al segundo pocillo del plato.
Use un par de pinzas para sostener el abdomen en el extremo posterior y empuje lentamente los ovarios hacia afuera (junto con el resto del contenido abdominal) con el otro par de pinzas. En caso de que este intento falle, retire con cuidado el exoesqueleto abdominal insertando las pinzas en el extremo anterior para liberar los ovarios.
Con las pinzas, sostenga un ovario individual por el extremo posterior opaco (es decir, los huevos en etapa tardía llenos de yema) y muévalo con cuidado al tercer pocillo de la placa para procesarlo para la microscopía en vivo o para su fijación para realizar la inmunotinción.
Cepille con cuidado la vaina protectora alrededor de los ovarios deslizando ligeramente una aguja de provocación desde el extremo posterior hasta el extremo anterior de cada ovario mientras lo sostiene por el extremo posterior con un par de pinzas><. NOTA: Para minimizar el daño durante la provocación, doble la punta de la aguja y acerque cada ovario aumentando el aumento del microscopio (Figura 1A). Las burlas deben ser lo suficientemente efectivas como para romper la vaina, pero también deben hacerse con cuidado para preservar la integridad de los ovarios.

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Resultados

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Figura 1: Plan experimental y preparación. (A) Herramientas utilizadas en los métodos descritos: A. Vial de mosca; B. Medio de disección de insectos; C. Paraformaldehído; D. Cepillo para moscas; E. Plato de disección; F. Cubreobjetos; G. Tubo de microfuga. H. Plato con fondo de vidrio; I. Corredera de vidrio; J. Micropipeta de 1.000 μL; K. Micropipeta de 200 μL; L. Micropipeta de 2,5 μl;...