Este protocolo es un extracto de Eidhof et al., High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay, J. Vis. Exp. (2017).
1. Construcción de la caja de ensayo de la isla
- Prepare una bandeja hecha de un material resistente, como el polimetacrilato de metilo (PMMA), para que contenga una capa de agua (es decir, un baño). Asegúrese de que el material no sea blanco.
NOTA: Se recomiendan unas dimensiones de 40 x 35 x 2,5cm3 (Figura 1A).
- Prepare una caja (42 x 38 x 25 cm3) hecha de un material robusto y transparente, como el PMMA, para colocarla alrededor de la bañera para evitar que las moscas se escapen al espacio del laboratorio. Coloque un agujero (20 x 30 cm2) en el lado lateral que sea lo suficientemente grande para que el experimentador pueda manipular fácilmente los viales con moscas y dejarlos caer en la isla (Figura 1A).
- Prepare una plataforma elevada de 10 x 15 x 2,5 cm3 de dimensión, hecha de un material impermeable (PMMA o plástico) que sea impermeable.
NOTA: Se requiere que esta plataforma tenga una superficie blanca uniforme para garantizar un buen contraste para el análisis de imágenes. El tamaño no es necesariamente fijo, pero debe ser lo suficientemente grande como para asegurarse de que todas las moscas se posen inicialmente en la plataforma y tengan la oportunidad de caminar sobre ella (Figura 1A).
- Fije la plataforma pegándola a la bañera o colocando pesas u otros objetos pesados dentro de la caja de la plataforma para evitar cambios de posición de la plataforma durante la sesión de experimentación/filmación.
2. Requisitos e instalación del software
- Instalación de software de grabación de imágenes.
- Descargue el software de grabación de imágenes para registrar la serie de imágenes de la isla (consulte la Tabla de Materiales) e instale el software en una computadora.
NOTA: El software de grabación de imágenes descrito en este protocolo solo es compatible con Windows. Se ha añadido una alternativa para otros usuarios a la Tabla de Materiales.
3. Preparación de las moscas que se van a probar en el ensayo de la isla
- Recoja moscas en etapas para cada condición experimental bajo anestesia fría o de dióxido de carbono (CO2), como se describió anteriormente (durante un período de 1 a 2 días).
- Prepare un mínimo de 3 viales de muestra por condición experimental, cada uno de los cuales contiene aproximadamente 15 moscas en etapas. Solo use moscas con las alas intactas y que sean de edad y sexo similares.
NOTA: Para los experimentos aquí descritos, 5 viales de muestra que contenían 15 moscas macho de los genotipos w-; Actina-Gal4/+ (control) y w-; Se recolectaron Actin-Gal4/GD11950 (TEFU RNAi) el día de la eclosión, envejecidos durante 4 días, y se utilizaron para realizar el ensayo en isla. El ARNi, las cepas de control y el controlador Actin-gal4 se obtuvieron de una fuente comercial (consulte la Tabla de materiales).
- Deje que las moscas se recuperen para evitar los efectos de los anestésicos (al menos 1 día cuando se usa CO2) antes de analizar las moscas recolectadas en la isla a la edad de interés.
4. Configuración experimental
NOTA: Ver Figura 1B.
- Agregue agua fría con una pequeña cantidad de jabón a la bandeja de baño y coloque la plataforma en el medio.
NOTA: El jabón disminuye la tensión superficial del agua; Las moscas que toquen el agua se ahogarán. Esto evita que cantidades crecientes de moscas vuelen en la caja durante la progresión de la sesión experimental.
- Coloque la caja transparente encima de la bandeja e ilumine la plataforma desde arriba con una lámpara.
NOTA: La iluminación de la plataforma es necesaria principalmente para garantizar un contraste de video adecuado. Una luz LED ordinaria de 12 V es apropiada para esto.
- Coloque la cámara web directamente encima de la plataforma (fuera de la caja) y conéctela a una computadora.
- Cree nuevas carpetas en el equipo para almacenar los diferentes datos experimentales previos a los experimentos.
- Siga la estructura del ejemplo ilustrado en Figure 2A para crear las carpetas. Por ejemplo, si el diseño experimental requiere probar dos genotipos con cinco réplicas cada uno, primero cree una carpeta principal que contenga la fecha del experimento. Dentro de la carpeta principal, cree dos subcarpetas (una por genotipo). Dentro de las carpetas de genotipos, cree cinco nuevas subcarpetas, una por replicate.
NOTA: Para un análisis posterior, es esencial que las series de imágenes correspondientes a experimentos individuales se guarden en carpetas con nombres únicos.
5. Configuración de la configuración de video en la sección "Dispositivo de captura" de la interfaz
- Abra el software de grabación de imágenes y, en la pestaña "Captura", haga clic en "Imágenes de lapso de tiempo..." y seleccione la cámara web adecuada como "Dispositivo de captura".
- Coloque una mosca muerta en la isla; ajuste la configuración del video haciendo clic en el cuadro "Configuración de video". Desplácese por las barras de herramientas, ajustando el brillo, el contraste y el color de tal manera que la mosca muerta aparezca negra sobre un fondo blanco (Figura 2B). Cuando se completen los ajustes, haga clic en "Aceptar".
6. Configuración de la grabación y el almacenamiento de vídeo en la sección "Time-lapse" de la interfaz
- Ajuste la configuración en la "Configuración de película de lapso de tiempo" para guardar el experimento como un archivo .avi. Haga clic en "Examinar...", seleccione el directorio donde se almacenará la película, defina el nombre del video y presione "guardar".
NOTA: El archivo de vídeo no se utiliza para la cuantificación de datos; Sin embargo, puede ser útil tener una idea general sobre el experimento.
- Ajuste la configuración en la sección "Configuración de película time-lapse".
- En el cuadro de compresión, seleccione "Código Intel IYUV" para la compresión de vídeo y elija "Tomar un fotograma cada 0,1 segundos", con la "Tasa de reproducción (imágenes por segundo):" en 10.
- Guarde las series temporales del experimento como fotogramas .bmp haciendo clic en "Avanzado..." Seleccione "Crear una imagen .bmp para cada fotograma capturado". Haga clic en "Examinar". Seleccione el mismo directorio en la ventana "Durante la captura de vídeo AVI" (como se eligió en el paso 6.1), haga clic en "Abrir" y pulse "Aceptar".
NOTA: Tenga en cuenta que, durante el experimento, los fotogramas se almacenan como archivos .bmp (necesarios para el análisis de datos). El programa nombra los fotogramas como "A" seguido del número correspondiente a la secuencia de captura de fotogramas (por ejemplo, "A_number.bmp") (Figura 2C). Guarde siempre las imágenes que pertenezcan a diferentes experimentos en una nueva carpeta para asegurarse de que no se sobrescriban las series de imágenes grabadas anteriormente. Tenga en cuenta que las imágenes no se guardan automáticamente en la misma carpeta que el archivo de video a menos que esta carpeta esté seleccionada en "Examinar..." al hacer clic en el cuadro "Avanzado".
7. Ensayo de la isla y recopilación de datos
- Presione el botón de inicio en la interfaz de imagen de lapso de tiempo del software de grabación de imágenes para iniciar la grabación.
- Golpee el vial experimental que contiene moscas (paso 3) 2-3 veces para asegurarse de que las moscas estén en el fondo del vial. Retire rápidamente el tapón del vial y, con un movimiento vigoroso, golpee el vial en la plataforma para que todas las moscas caigan sobre la plataforma al mismo tiempo (Figura 1C).
- Después de aproximadamente 30 segundos, presione el botón "Detener" para detener la grabación.
NOTA: Si todas las moscas desaparecen de la plataforma, la grabación se puede detener antes.
- Retire las moscas que permanezcan durante 30 s en la plataforma con la mano después de detener la grabación de la imagen.
- Antes de continuar con la grabación del siguiente experimento, cambie el directorio de destino para los archivos .bmp y películas (consulte la sección 6).
