Este protocolo es un extracto de Bovier et al., Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2019).
1. Preparación de alimentos
- Para el mantenimiento de las existencias y el crecimiento de las larvas, utilice un medio de harina de maíz que contenga un 3% de levadura en polvo, un 10% de sacarosa, un 9% de harina de maíz precocida, un 0,4% de agar, a partir de entonces llamado medio de harina de maíz (CM).
- Pon 30 g de levadura en 100 ml de agua del grifo, llévala a ebullición y déjala hervir durante 15 min.
- Por separado, mezcle bien 90 g de harina de maíz precocida, 100 g de azúcar y 4 g de agar en 900 ml de agua del grifo.
- Lleve la solución a ebullición, baje el fuego y cocine durante 5 minutos revolviendo continuamente.
- Después de 5 minutos, agregue la solución de levadura caliente y cocine a fuego lento durante otros 15 minutos.
- Apague la fuente de calor y deje que la solución se enfríe a unos 60 °C.
- Agregue 5 mL/L de 4-hidroxibenzoato de metilo al 10% en etanol, mezcle bien y deje reposar durante 10 min.
NOTA: Hay que tener cuidado con la cantidad de 4-hidroxibenzoato de metilo, dado que una alta concentración de fungicida podría ser letal para las larvas.
- Dispense el medio en viales/frascos: 8 mL en cada vial de mosca (25 mm x 95 mm), 3 mL en cada vial de mosca (22 mm x 63 mm) y 60 mL en cada frasco de mosca (250 mL).
- Cubra los viales con una gasa y déjelos secar a temperatura ambiente (RT) durante 24 horas antes de almacenarlos.
- Calibrar experimentalmente la consistencia e hidratación correctas del CM modificando la cantidad de agar utilizada y/o los tiempos de enfriamiento/secado.
NOTA: los viales desenchufados, en caja y envueltos son estables durante unos 15 días a 4 °C.
- Para los adultos de Drosophila, use un medio que contenga 10% de levadura en polvo, 10% de sacarosa, 2% de agar, a partir de entonces llamado medio adulto (AM).
- Mezclar 10 g de levadura en polvo, 10 g de sacarosa, 2 g de agar en 100 mL de agua destilada.
- Lleve esta mezcla a ebullición dos veces, con un intervalo de 3 minutos, o hasta que el agar se disuelva, usando un microondas.
- Una vez que la solución se enfríe a 60 °C, agregue 5 mL/L de 4-hidroxibenzoato de metilo al 10% en etanol, mezcle bien y dispense en viales (10 mL por vial).
- Cubra los viales con una gasa y déjelos secar a RT durante 24 h antes de guardarlos.
NOTA: los viales desenchufados, en caja y envueltos son estables durante unos 15 días a 4 °C.
2. Dosificación de Drosophila EDC
- Prepare una solución madre adecuada, disolviendo el EDC seleccionado en el disolvente adecuado. Para el EE2 (peso molecular 296.403), disuelva 1,48 g en 10 mL de etanol al 100% para hacer una solución madre de 0,5 M y almacene a -80 °C.
cautela: Los EDC se consideran contaminantes ambientales y se deben tomar precauciones al manipularlos.
- Diluir la solución madre de EE2 en etanol al 10% en agua (v/v) para obtener una solución de 100 mM. Realizar las siguientes diluciones (0,1 mM, 0,5 mM y 1 mM) en los alimentos CM, comenzando por la concentración más baja y utilizando la misma concentración final de disolvente para cada grupo de tratamiento. Para los viales de control, utilice el mismo volumen de disolvente solo.
NOTA: se recomienda mantener la concentración final del solvente lo más baja posible, teniendo en cuenta que la concentración final de etanol no debe exceder el 2% en el alimento para moscas.
- Añadir la solución que contiene la dilución correcta del EDC seleccionado al alimento a base de harina de maíz antes de la solidificación, mezclar bien con un procesador de alimentos, dispensar 10 mL en viales, cubrir con gasa de algodón y dejar secar a RT durante 16 h antes de usar.
NOTA: utilice este medio inmediatamente después de su preparación.
- Para la cría de adultos, prepare diferentes soluciones de EE2 de trabajo (10 mM, 50 mM y 100 mM, respectivamente) en etanol al 10% en agua (v/v) y capa de 100 μL de cada una sobre la superficie de la AM, con el fin de obtener la concentración deseada de EE2 (0,1 mM, 0,5 mM y 1 mM). Para el control, utilice el mismo volumen del disolvente solo.
NOTA: alternativamente, agregue la solución que contiene la dilución correcta del EDC seleccionado a una pequeña cantidad de AM en un tubo cónico de 50 mL, haga un vórtice a fondo y estratifique 1 mL de la misma en la superficie de los viales de AM.
- Cubra los viales con gasa de algodón, deje secar a RT durante 12-16 h bajo agitación suave y utilícelos inmediatamente.
NOTA: el proceso de secado debe ajustarse experimentalmente porque depende de la humedad ambiental.
3. Cría de moscas
- Utilice una cepa isogénica robusta, como Oregon R, mantenida por varias generaciones en el laboratorio.
- Mantener las moscas en una incubadora humidificada a temperatura controlada, con luz natural de 12 h: fotoperiodo oscuro de 12 h a 25 °C en viales que contengan alimento CM.
- En cada ensayo, use viales en RT.
4. Protocolo de vida útil
- Prepare 20 viales de moscas con 8 hembras y 4 machos y los aloje a 25 °C en CM (10 mL cada uno).
- Después de 4 días, deseche las moscas y vuelva a colocar los viales en la incubadora><.
NOTA: estas moscas se pueden usar para comenzar de nuevo para obtener otras cohortes de moscas sincronizadas con la edad.
- Al final de la tarde del día 9, retire todas las moscas recién encerradas de los viales y devuelva los viales a la incubadora.
NOTA: algunos adultos deben comenzar a cerrar a partir del noveno día; El descarte de estas moscas permite recolectar un número máximo de moscas sincronizadas, evitando la selección descuidada de moscas emergentes tempranas.
- 16-24 h más tarde, transfiera las moscas adultas (de 1 día de edad) de ambos sexos a cuatro grupos de frascos de 250 mL que contengan alimento AM suplementado con tres concentraciones diferentes de EDC y una con el disolvente solo. Si es necesario, recoja otro lote al día siguiente.
- Mantenga las moscas a 25 °C durante 2-3 días para permitirles aparearse.
NOTA: el día de la transferencia a los viales de alimentos AM corresponde al primer día de la edad adulta.
- Después de dos o tres días, clasifique cada cohorte de moscas por sexo en dos grupos bajo anestesia ligera con CO2. Subdivida aleatoriamente cada sexo en cinco viales por tratamiento a una densidad de 20 individuos por vial, hasta que haya tres réplicas de 5 viales paralelos para cada sexo por cada tratamiento><.
NOTA: Trabaje con pequeños grupos de moscas para prevenir posibles problemas de salud duraderos debido al tiempo de exposición prolongado al CO2.
- Prepare una hoja de cálculo de vida útil en la que se reste el número de moscas muertas del número de moscas supervivientes a la transferencia anterior, de tal manera que se obtenga automáticamente el número de supervivientes en cada transferencia.
- Transfiera las moscas a nuevos viales que contengan el alimento correspondiente cada 3 días al mismo tiempo y verifique si hay muerte.
NOTA: la transferencia debe realizarse sin anestesia que podría tener un efecto negativo a largo plazo en la longevidad de la mosca.
- En cada traslado, anote la edad de las moscas y el número de moscas muertas.
NOTA: el número de moscas supervivientes se calcula automáticamente en la hoja de cálculo, pero se recomienda comprobarlo visualmente. No se deben tener en cuenta las moscas que escapan o mueren accidentalmente durante la transferencia. Tenga cuidado de no contar dos veces las moscas muertas llevadas al nuevo vial, informando esta nota en la hoja de cálculo.
- Repita los pasos 4.8 y 4.8.1 hasta que mueran todas las moscas.
- Para cada grupo de tratamiento, cree una curva de supervivencia como se muestra en Figura 1, con el fin de mostrar la probabilidad de supervivencia de una mosca en un momento determinado.
- Realice tres experimentos independientes para cada grupo de tratamiento de moscas, utilizando 100 moscas recién cerradas para cada experimento.
- Prepare una tabla en la que se informe de la esperanza de vida media (días medios de supervivencia de todas las moscas para cada grupo), el tiempo de muerte media (período de tiempo en días requerido para alcanzar el 50% de mortalidad) y la esperanza de vida máxima (cantidad máxima de días necesarios para alcanzar el 90% de mortalidad).
- Calcular las diferencias porcentuales entre cada grupo de tratamiento con respecto al grupo control.
- Realizar análisis estadísticos para comparar los diferentes grupos de tratamiento.
