$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Este protocolo es un extracto de Castells-Nobau et al., Dos algoritmos para la cuantificación multiparamétrica y de alto rendimiento de la morfología de la unión euromuscular de Drosophila N, J. Vis. Exp. (2017).
1. Requisitos previos al procesamiento de imágenes
- Realizar preparaciones de libro abierto de Drosophila de larvas errantes de tercer estadio (L3), como se describió anteriormente.
- Co-immunomarcaje de terminales de Drosophila NMJ utilizando una combinación de dos marcadores: Dlg-1 o Hrp junto con Brp para análisis con "Drosophila NMJ Morphometrics", y Syt o Csp junto con Brp para análisis con "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics".
NOTA: Los anticuerpos de la misma especie se pueden combinar mediante el etiquetado previo de uno con un kit de conjugación de anticuerpos, como los kits de etiquetado Zenon Alexa.
- Obtener imágenes de los terminales NMJ utilizando un microscopio de su elección, por ejemplo, fluorescencia (con o sin ApoTome) o microscopía confocal.
- Adquiera una pila de imágenes de 2 canales del terminal NMJ.
- Ajuste la configuración del microscopio de manera que el canal 1 adquiera el terminal NMJ inmunomarcado con Dlg-1 (o Hrp, Syt, Csp) y el canal 2 el terminal NMJ inmunomarcado con Brp.
- Opcionalmente, analice imágenes de un canal (de sinapsis inmunomarcadas con un solo anticuerpo) con las macros. Imagen de NMJs inmunomarcados únicamente con Dlg-1 o Hrp para análisis con "Drosophila NMJ Morphometrics", o Syt o Csp para "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics".
NOTA: No es posible analizar sinapsis inmunoteñidas solo con anti-Brp.
- Exporte las imágenes obtenidas como archivos .tiff individuales. Invierta el orden de los canales antes de ejecutar las macros si no se adquieren como se indica.
2. Requisitos e instalación del software
- Descargue las macros: "Drosophila NMJ Morphometrics" y "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics" del siguiente sitio web: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.2077399.v1.
- Mueva el cursor a la carpeta "Actualización de macros 1" y haga clic en la opción que aparece "ver". Aparecerá una lista con el contenido de esta carpeta. La carpeta contiene las macros "Drosophila NMJ Morphometrics" y "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics".
NOTA: Ambas macros son compatibles con las versiones 1.4 de Fiji, que también se proporcionan en la misma carpeta. Es posible que las macros no se ejecuten en versiones recientes. Utilice la versión 1.4 proporcionada. No es problemático iniciar esta versión, incluso en computadoras con una versión más reciente de Fiji disponible.
- Haga clic en "Descargar todo". El contenido de la carpeta se descargará en la computadora como un archivo .zip. Descomprime el archivo descargado.
- Copie los archivos Drosophila_NMJ_Morphometrics.ijm y Drosophila_NMJ_Bouton Morphometrics.ijm en Fiji.app/plugins/ directorio. Al reiniciar el programa, las macros aparecerán en la parte inferior del menú desplegable Plugins.
3. Ejecute la sub-macro "Convertir en pila" para crear proyecciones Z e hiperpilas de las imágenes NMJ
- Inicie la interfaz gráfica seleccionando Plugins en la barra de herramientas y elija "Drosophila NMJ Morphometrics" en el menú desplegable.
- Defina la configuración "Cadena de archivo única" en la interfaz gráfica de la macro.
NOTA: El software del microscopio utiliza una firma de identificación para organizar los planos y los canales cuando se almacenan pilas como archivos .tiff individuales. La configuración de la cadena de archivo única ingresada debe especificar la firma asignada por el software al primer plano del primer canal (importante: se debe indicar el plano más bajo y el número de canal).
- Seleccione solo la sub-macro "Convertir en pila" y haga clic en "aceptar" y seleccione la carpeta donde se encuentran las imágenes. Si se selecciona un directorio principal con varias subcarpetas, se procesarán todos los archivos '.tiff individuales dentro del directorio principal y la subcarpeta que coincidan con los criterios de cadena de archivo únicos.
- Si la pila z solo contiene un canal, seleccione la casilla "Solo canal 1".
- Tenga en cuenta que aparecerán dos archivos nuevos por imagen NMJ, denominados de forma predeterminada como stack_image_name y flatstack_image_name. Almacene solo estas pilas y pilas planas para su posterior análisis. La serie de archivos .tiff se puede eliminar en este punto, minimizando las capacidades de almacenamiento necesarias y evitando posibles fuentes de error.
4. Ejecute la sub-macro "Definir ROI" para delinear el terminal NMJ de interés
- Inicie la interfaz gráfica de "Drosophila NMJ Morphometrics".
- Seleccione solo la casilla de verificación "Definir ROI" y presione "OK" y seleccione el directorio principal donde se almacenan las imágenes con flatstack_name y presione "Seleccionar". La sub-macro "Definir ROI" busca automáticamente a través de todas las subcarpetas dentro del directorio principal seleccionado.
- Cuando se abra la primera proyección, seleccione la herramienta "Selecciones a mano alzada" en la barra de herramientas.
- Con el ratón, dibuje una selección que contenga exclusivamente el terminal NMJ completo de interés y haga clic en "Aceptar" en la ventana "Definir terminal". La macro continuará con la siguiente proyección.
- Delinee el siguiente ROI y repita hasta que se definan todos los ROI. El archivo de imagen ROI, denominado "roi_image_name", se almacenará en el mismo directorio que las imágenes de pila y proyección generadas anteriormente para cada una de las imágenes procesadas. La salida de esta sub-macro es una imagen binaria del ROI en blanco sobre un fondo negro.
5. Ejecute la sub-macro "Analizar" para cuantificar las características del terminal NMJ
- Vaya a la barra de herramientas, seleccione "Plugins" y use:
"Drosophila_NMJ_Morphometrics" cuando se analizan sinapsis inmunomarcadas con anti-Dlg-1 o anti-Hrp (canal 1) junto con anti-Brp (canal 2), o "Drosophila_NMJ_Bouton_Morphometrics" cuando se analizan sinapsis inmunomarcadas con anti-Syt o anti-Csp (canal 1) junto con Brp (canal 2).
- Cuando se van a analizar pilas de imágenes de un canal (el canal estructural Dlg-1 o HRP para "Drosophila_NMJ_Morphometrics", o Syt o Csp para "Drosophila_NMJ__Bouton_Morphometrics"), seleccione la casilla "Solo canal 1".
- Ajuste la escala correspondiente a las imágenes a analizar.
- Si un píxel de la imagen corresponde a 2,5 μm, indique Escala-Píxeles = 1, Escala-Distancia en μm = 2,5. En caso de que ambas configuraciones se dejen en 0, el área NMJ, el perímetro, la longitud y la longitud de la rama más larga se expresarán en número de píxeles.
- Si es necesario, ajuste la configuración de análisis predeterminada de la macro. Realice ajustes solo si la sub-macro "Analizar" se ha ejecutado previamente con resultados insatisfactorios (consulte el final de esta sección y la sección 6 para obtener instrucciones sobre cómo optimizar la configuración).
- Seleccione las casillas de verificación "Analizar" y "Esperar" y presione "Aceptar".
- Seleccione la casilla de verificación "Esperar" cuando ejecute la submacro "Analizar" en imágenes de 2 canales. De lo contrario, pueden producirse errores en el recuento de zonas activas debido a las capacidades limitadas de los ordenadores.
- Cuando se abra una nueva ventana "Elegir un directorio", seleccione el directorio donde se encuentran las imágenes y presione "seleccionar". La macro analizará todas las imágenes almacenadas en el directorio principal y, si corresponde, en las carpetas posteriores (utilizando los tres archivos de la ejecución de las submacros anteriores: stack_image_name, flatstack_image_name y roi_image_name). La macro procesa cada imagen de forma individual y consecutiva. Esto puede tardar varios minutos por pila de imágenes (dependiendo de la capacidad del equipo).
- Después de ejecutar la macro, tenga en cuenta que se creará un nuevo archivo de imagen llamado res_image_name para cada sinapsis analizada almacenada en la carpeta principal. Las mediciones cuantitativas se almacenarán como un archivo "results.txt".
- Inspeccione todas las imágenes de resultados para detectar y excluir imágenes con errores de segmentación. Los posibles errores de segmentación se describen en la Tabla 1, junto con consejos sobre cómo ajustar la configuración para evitar estos errores. Las imágenes de resultados con tales errores de segmentación se proporcionan como ejemplos en Figure 1.
NOTA: Al ejecutar la macro con la configuración predeterminada observada en la interfaz de usuario, hubo una precisión de aproximadamente el 95% cuando se comparó la evaluación de macros con la evaluación manual.
6. Ajuste la configuración de macros a las imágenes
- Cuando más del 5% de las imágenes muestren errores de segmentación, explore los diferentes algoritmos para definir/elegir la configuración de macro más adecuada para las imágenes.
- Ajuste el valor del radio de la bola rodante
NOTA: La función de radio de la bola rodante resta el fondo de la imagen. Esta función es de crucial importancia cuando se trabaja con imágenes adquiridas en microscopios de fluorescencia y/o cuando las imágenes tienen un alto ruido de fondo. La sustracción del fondo ayudará a que los pasos de umbral automático de la macro produzcan una segmentación adecuada de los terminales NMJ.
- Seleccione tres imágenes de stack_image_name NMJ generadas por la submacro "Convertir en pila". Elija imágenes que sean representativas del conjunto de datos de imágenes.
- En la barra de herramientas, seleccione Imagen | Colores | Canales divididos. Se crearán dos pilas de imágenes, una que representa el canal 1 y la otra el canal 2, respectivamente, y se guardarán.
- Abra la pila de imágenes perteneciente al canal 1 abierto, correspondiente al inmunomarcaje Dlg-1, Hrp, Syt o Csp.
- Ejecute el filtro "Restar fondo" seleccionando "Proceso" en la barra de herramientas seguido de "Restar fondo..." en el menú desplegable.
- Haga clic en la casilla de verificación de vista previa en la ventana emergente y ajuste el radio de la bola rodante al valor más apropiado para las imágenes. El ajuste "Radio de la bola rodante" debe ajustarse a valores que aumenten el contraste entre la sinapsis y el fondo (ver Figura 2A').
- Consulte Figura 2 para ver un ejemplo. En el panel A, partes de la sinapsis muestran los mismos niveles de gris que el fondo, mientras que en el panel A' de Figure 2' un "radio de bola rodante" de 500 da como resultado un fuerte contraste entre la sinapsis y el fondo.
- Cree una proyección z seleccionando en la barra de herramientas Imagen | Pila | Proyección Z, elija Tipo de proyección = Intensidad máxima y guarde la imagen resultante. Cuando se haya definido el valor adecuado para el radio de la bola rodante, ejecute el algoritmo "Restar fondo" en las imágenes representativas restantes con el mismo valor de radio de la bola rodante. Cree las proyecciones Z y guárdelas (en cualquier directorio).
NOTA: El valor del radio de la bola rodante para imágenes de 8 bits o RGB debe ser al menos tan grande como el radio del objeto más grande de la imagen que no forme parte del fondo. Para imágenes de 16 bits y 32 bits, el radio debe ser inversamente proporcional al rango de valores de píxel.
- Determine los diferentes umbrales automáticos que se utilizarán
- Abra las proyecciones Z guardadas en el paso anterior (6.2.6) y seleccione imagen | Ajustar | Umbral automático | Pruébalo todo.
- Como aparecerá una imagen de resultado con umbral binario con todos los diferentes algoritmos de umbral automático, determine el algoritmo más adecuado para las imágenes.
- Al ejecutar la macro más adelante, cambie el umbral en la configuración de la macro en consecuencia.
- Utilice umbrales más restrictivos como "RenyiEntrophy" o "Moments" como umbral de contorno NMJ y umbrales más permisivos como "Li" para determinar el esqueleto NMJ y "Huang" para determinar las zonas activas. Cuando las imágenes son muy nítidas con poco o ningún fondo, use "Huang" como umbral de contorno NMJ. De lo contrario, es posible que falten partes de la sinapsis después de la segmentación de la imagen.
- Véase Figura 2B para ver un ejemplo. La segmentación adecuada de la sinapsis se obtiene con umbrales automáticos resaltados por cuadros verdes. Algunos ejemplos de umbrales inadecuados se resaltan con recuadros rojos (compruebe las sinapsis a gran aumento). En este último, faltan partes de la sinapsis o se incluyen partes del fondo.
- Determine el tamaño máximo de las partículas pequeñas
NOTA: Esta función excluirá del análisis todas las partículas detectadas por el umbral de contorno NMJ y el umbral de esqueleto que sean más pequeñas que el valor definido en la "configuración de partículas pequeñas". Este valor se define en píxeles. Esta función sirve como filtro de ruido y es muy útil cuando hay altas tasas de fondo no uniforme (como cristales/polvo) en las imágenes obtenidas.
- Abra las proyecciones Z guardadas en el paso 6.2.6 y configure la escala para detectar el número de píxeles a través de Analizar | Establecer escala. Aplique los siguientes ajustes: distancia en píxeles = 1, distancia conocida = 1, relación de aspecto de píxeles = 1, unidad de longitud = píxel y presione "Aceptar". Haga clic en la herramienta "Selección ovalada" en la barra de herramientas.
- Con el ratón, dibuje una selección que rodee estrechamente a las partículas individuales que están presentes en la inmunotinción pero que no pertenecen a la NMJ. Presione Ctrl+m para un usuario de Windows o cmd+m para usuarios de Mac. Se abrirá una ventana de resultados, que indica el área de las partículas seleccionadas en número de píxeles.
- Repita el paso anterior varias veces con varios artefactos presentes en las imágenes para determinar el área de partícula/artefacto contaminante más grande. Este será el valor que se establecerá en la configuración cuando se ejecute la macro más adelante. Al ejecutar la macro, establezca el "Tamaño de partículas pequeñas" como el tamaño de partícula más pequeño observado pus un margen del 25%.
- Véase Figura 2D para ver un ejemplo. El cristal más grande detectado tiene un área de 112 píxeles. El ajuste "Tamaño de partículas pequeñas", al procesar esta imagen con la macro, debe establecerse en 125 - 150.
- Determine el tamaño mínimo del botón
NOTA: Esta función excluirá del análisis todos los botones detectados por el umbral de contorno NMJ que sean más pequeños que el valor definido. Este valor se define en píxeles.
- Siga los mismos pasos que se describen en la sección 6.4, pero en este caso dibuje una selección alrededor de los botones más pequeños presentes en el terminal NMJ. Elija el área más pequeña que corresponda al botón más pequeño de los medidos. Este es el valor que se debe establecer en la configuración de tamaño mínimo del botón al ejecutar la macro más adelante.
- Definir el valor de "Tolerancia máxima al ruido"
- Para definir el valor de "Encontrar la tolerancia máxima al ruido" para la macro, abra la pila Z del canal 2 guardada en la sección 6.2.2.
- Ve a la pestaña de plugins en el menú emergente, selecciona Proceso | Máximo(3D) y, cuando aparezca el maximum_image_name (que puede tardar unos minutos), cierre la pila de imágenes original.
- Seleccione la Maximum..._image_name (la pila de imágenes recién obtenida) y seleccione Plugins | Proceso | Mínimo (3D), cuando aparece el nuevo Mínimo de Maximum..._image_name aparece el Máximo... _image_name pila.
- En la barra de herramientas, seleccione Proceso | Encuentra máximos.... Se abrirá una nueva ventana "Buscar máximos...". Haga clic en la casilla de verificación "Vista previa de la selección de punto..." y rellene la casilla "Tolerancia al ruido" con la configuración de macro predeterminada 50. Los puntos máximos se indicarán en la imagen como pequeñas cruces.
- Aumente el valor de "Tolerancia al ruido" si observa un exceso de zonas activas anotadas, es decir, cruces que no están encima de las zonas activas que no están enfocadas en el plano de pila seleccionado, o zonas activas falsas que se detectan en segundo plano.
- Por otro lado, si observa zonas activas anotadas de forma incompleta, es decir, zonas activas enfocadas que no se reconocen, disminuya el valor de "Tolerancia máxima al ruido". Siga probando diferentes valores siguiendo este procedimiento hasta que las cruces etiqueten correctamente las zonas activas en el foco. Rellene la opción "Buscar tolerancia máxima al ruido" con este valor.
- Véase Figura 2C para ver un ejemplo. Se detectan demasiadas zonas activas. En Figura 2C' solo se detectan las zonas activas enfocadas al aumentar el valor de "Tolerancia máxima al ruido".
- Ejecute la sub-macro "Analizar" para las imágenes representativas seleccionadas en el paso 5.1, con la configuración definida en todos los pasos anteriores.
- Ajuste del umbral inferior y superior de Brp-puncta
- Tenga en cuenta que aparecerá un nuevo archivo después de ejecutar la macro de acuerdo con el paso 6.6, llamado 2_active_zone_stack_image_name. En esta pila de imágenes, las zonas activas detectadas por la función "Buscar máximos" se indican con puntos blancos en cada plano.
- Abra este archivo arrastrándolo y soltándolo en la barra de herramientas y seleccione Imagen | Pila | Proyecto Z | Tipo de proyección = Segmentos de suma. Se obtendrá una proyección de la 2_active_zone_stack_image_name.
- Seleccionar imagen | Ajustar | Umbral. Se abrirá una nueva ventana "Umbral". Deslice la barra superior para elegir un valor de umbral en el que todos los focos deseados/puntos positivos de Brp se visualicen en rojo.
NOTA: Si el umbral se establece demasiado bajo, se contará un exceso de zonas activas. Si se establece demasiado alto, se perderá una fracción de las zonas activas.
- Consulte Figura 2E para ver un ejemplo. Cuando el umbral se establece en 400, la mayoría de las zonas activas (simbolizadas como focos de 1 píxel) no se incluyen en la segmentación, ya que no se resaltan en rojo (Figura 2E). Cuando el umbral se establece en un valor de 50, todas las zonas activas se resaltan en rojo (Figura 2E').
- Defina este valor como umbral mínimo. Deje "Umbral superior de puntuación" en el valor máximo.
- Vuelva a ejecutar la sub-macro "Analizar" para las imágenes representativas con la configuración definida en todos los pasos anteriores de esta sección. Evalúe críticamente los archivos de imagen resultantes y asegúrese de que la segmentación se realice correctamente. Si este no es el caso, reajuste la configuración de acuerdo con la naturaleza de los errores de segmentación (Figura 1, Tabla 1).
