Lesión neuronal inducida por láser de dos fotones: un método para observar la degeneración y regeneración de los axones en larvas de Drosophila

Resumen

Fuente: Li, D., et al. Un modelo de lesión in vivo de Drosophila para estudiar la neurorregeneración en el sistema nervioso periférico y central. J. Vis. Exp. (2018).

Este video describe la ablación de axones con láser de dos fotones en una larva de Drosophila melanogaster y un ejemplo de protocolo para inducir lesiones e imágenes del sitio de la lesión.

Protocolo

Este protocolo es un extracto de Li et al., Un modelo de lesión in vivo de Drosophila para estudiar la neuroregeneración en el sistema nervioso periférico y central, J. Vis. Exp. (2018).

1. Lesión de dos fotones e imágenes confocales

1. Configuración del microscopio
   NOTA: Para este experimento se utilizó un microscopio de barrido láser confocal con un láser de dos fotones, pero otros sistemas con una configuración equivalente también serán suficientes. Se utilizó el láser de dos fotones (930 nm) para la administración de lesiones y un láser de argón (488 nm) para la obtención de imágenes confocales de GFP.
   1. Al comienzo de cada sesión, encienda el láser de dos fotones y/o el/los láser(es) confocal, y el microscopio. Abra el software de imágenes.
   2. Para lesiones de dos fotones, configure los siguientes parámetros para obtener imágenes de GFP con el láser de dos fotones a 930 nm (1.950 mW).
      1. Seleccione el modo de escaneo de líneas. Abre el agujero por completo. Aumente la intensidad del láser a ~20% (390 mW).
      2. Seleccione 512 x 512 como escaneo de fotogramas. Utilice la velocidad máxima de escaneo (normalmente con un tiempo de permanencia de píxeles de 0,77 μs). Asegúrese de que el número medio sea 1 y que la profundidad de bits sea de 8 bits.
      3. Establezca la ganancia en ~750 y el desplazamiento en 0.
      4. Guarde este protocolo experimental preestablecido como 2P GFP 930 Ablation, lo que permite una fácil reutilización en futuros experimentos.
   3. Para la obtención de imágenes confocal, configure los siguientes parámetros para la obtención de imágenes GFP con el láser de argón a 488 nm:
      1. Seleccione la pestaña Adquisición y, a continuación, Z-stack.
      2. En "Láser", encienda el láser de argón de 488 nm.
      3. Vaya a Canales, seleccione el láser de 488 mm y aumente la potencia del láser al 5-10%. Para el agujero de alfiler, use la unidad aireada 1-2 (AU). Ajusta la ganancia a 650.
      4. En el modo de adquisición, seleccione 1024 x 1024 como escaneo de fotogramas, use la velocidad máxima de escaneo, un número promedio de 2 y una profundidad de bits de 8 bits.
      5. Guarde este protocolo experimental preestablecido como GFP Imaging.
2. Anestesia de larvas con éter dietílico y montaje
   1. En una campana extractora, coloque una placa de vidrio de 60 mm en una placa de Petri de plástico de 15 cm. Dobla y coloca un trozo de papel de seda en el fondo del plato de vidrio, luego coloca un plato de agar jugo de uva sobre el pañuelo. Agregue éter dietílico en el plato de vidrio, hasta el punto en que el papel de seda esté empapado y quede una capa de éter líquido en el plato. Mantenga la tapa puesta en todo momento.
   2. Prepara un portaobjetos de vidrio con una gota de aceite halocarbono 27 en el centro. Agregue 4 puntos de grasa de vacío en las cuatro esquinas del portaobjetos, para luego apoyar el cubreobjetos.
   3. Use pinzas para recoger una larva limpia y colóquela en la placa de agar en el plato de vidrio de 60 mm. Cubra el plato de vidrio con su tapa y espere hasta que la larva deje de moverse. En el caso de las lesiones o las imágenes del SNP, saque la larva tan pronto como su cola deje de temblar. Para el SNC, espere hasta que toda la larva quede inmóvil, especialmente los segmentos de la cabeza.
      NOTA: El momento de la exposición al éter es crítico. Véase Discusión.
   4. Levante con cuidado la larva anestesiada y colóquela con la cabeza hacia arriba en la gota de aceite de halocarbono en el portaobjetos. Añade un cubreobjetos en la parte superior del portaobjetos. Use una presión suave para empujar hacia abajo el cubreobjetos, hasta que toque la larva (Figura 1A).
   5. Ajuste la posición de la larva empujando suavemente el cubreobjetos hacia la izquierda o hacia la derecha para hacer rodar la larva, de modo que la neurona/axón/dendrita de interés esté en la parte superior y más cercana a la lente del microscopio.
   6. En el caso de una lesión por SNP, monte la larva con el lado dorsal hacia arriba, de modo que ambas tráqueas sean visibles. Luego gire la larva ~ 30 grados hacia la izquierda para dañar los axones de las neuronas de clase III da (Figura 1B y 1C), 90 grados para dañar los axones de las neuronas de clase IV da (Figura 1B y 1E), o ~ 30 grados para dañar las dendritas de las neuronas de clase IV da (Figura 2A).
   7. En el caso de lesiones en el SNC, coloque la larva perfectamente con el lado ventral hacia arriba (Figura 3A), de modo que la región de interés esté más cerca de la lente del microscopio en el plano z.
3. Lesión por láser de dos fotones
   1. Coloque el portaobjetos con la larva bajo el microscopio y asegúrelo en su lugar con el soporte del portaobjetos en la platina. Usa el objetivo 10X (0,3 NA) para encontrar la larva.
   2. Añade 1 gota de aceite de objetivo en el cubreobjetos, cambia al objetivo 40X (1,3 NA) y ajusta el enfoque.
   3. Cambie al modo de escaneo y reutilice el protocolo experimental 2P GFP 930 Ablation. Asegúrese de que el orificio esté completamente abierto.
      NOTA: La configuración debe optimizarse en función de los sistemas individuales.
   4. Inicie el modo En vivo para localizar la región de interés (ROI) y ajuste la configuración para lograr una buena calidad de imagen con el zoom adecuado.
      NOTA: El propósito de este paso es encontrar la neurona/axón/dendrita para lesionar, en lugar de tomar la imagen de mejor calidad. Por lo tanto, utilice los ajustes mínimos suficientes para visualizar el área objetivo, con el fin de evitar la sobreexposición o el fotoblanqueo.
   5. Detenga el escaneo en vivo, para que el botón Recortar esté disponible. Deje que la imagen fija sirva como hoja de ruta. Seleccione la función Recortar y ajuste la ventana de escaneo para centrarse en el objetivo que se va a lesionar.
   6. Reduzca el retorno de la inversión para que sea del tamaño del sitio prospectivo de la lesión. Por ejemplo, basta con cubrir el ancho de un axón o una dendrita, para garantizar la precisión de la lesión y reducir el daño a los tejidos vecinos. Si lo desea, amplíe el ROI antes de recortar, lo que permite una lesión más precisa.
   7. Abra una nueva ventana de imágenes. Reduzca la velocidad de escaneo y aumente la intensidad del láser. Determine el aumento de la intensidad del láser en función de la señal de fluorescencia tisular escaneada en el modo Live.
   8. Por lo general, establezca la intensidad del láser de dos fotones a partir del 25% para la lesión PNS y del 50-100% para la lesión VNC. Para la lesión de axones PNS, asegúrese de que la intensidad del láser sea de ~480 mW y que el tiempo de permanencia de los píxeles sea de 8,19 μs. Para la lesión del axón VNC, asegúrese de que la intensidad del láser y el tiempo de permanencia de los píxeles sean generalmente de 965-1930 mW y 8,19-32,77 μs, respectivamente.
   9. Inicie el escaneo continuo. Deje el cursor sobre el botón Continuo. Vigile de cerca la imagen y detenga el escaneo tan pronto como se observe un aumento drástico de la fluorescencia.
      NOTA: La aparición del pico de fluorescencia se debe a la autofluorescencia en el sitio de la lesión.
   10. Vuelva al modo En vivo reutilizando la configuración. Encuentre la región de interés a la que se acaba de apuntar ajustando el foco.
       NOTA: Una buena indicación de una lesión exitosa es la aparición de un pequeño cráter, una estructura en forma de anillo o escombros localizados justo en el sitio de la lesión.
   11. Pase a la siguiente neurona y repita desde el paso 1.3.5, para lesionar varias neuronas en un solo animal. O repita el paso 1.3.5 mientras aumenta gradualmente la potencia y/o reduce la velocidad de escaneo si la lesión inicial fue insuficiente.
       NOTA: En el caso de que la potencia del láser sea demasiado alta, se verá una gran área dañada en la imagen de escaneo en vivo posterior a la lesión. Demasiadas lesiones pueden causar la muerte de la larva.
   12. Recupere la larva retirando con cuidado el cubreobjetos y transfiriendo la larva lesionada a un nuevo plato con pasta de levadura. Zanja varias cuevas en la placa de agar con pinzas; Alternativamente, haga una isla de agar en el plato en lugar de usar todo el plato, para reducir la posibilidad de que la larva se arrastre fuera del plato.
   13. Colocar la placa en una placa de Petri de 60 mm con tejido húmedo (empapado con una solución de ácido propiónico al 0,5%) y cultivar a temperatura ambiente o a 25 °C.
       NOTA: La larva permanecerá en la etapa larvaria durante aproximadamente un día más a temperatura ambiente (22 °C) en comparación con 25 °C.
4. Imágenes confocales posteriores a la lesión
   1. Tome imágenes de la larva lesionada en los puntos de tiempo deseados preparando la larva utilizando el mismo procedimiento de anestesia y montaje que en el Paso 1.2, luego tome imágenes con el láser confocal><. NOTA: Obtener imágenes de la larva a las 24 h después de la lesión (AI) para confirmar la lesión axonal y a las 48 h AI (neuronas da clase IV) o 72 h IA (neuronas da clase III) para evaluar la regeneración.
   2. Localiza la larva usando el objetivo 10X, luego cambia a un objetivo 25X (0.8 NA). Reutilizar el protocolo experimental GFP Imaging.
   3. Haga clic en el botón En vivo y encuentre la misma neurona lesionada anteriormente.
   4. Establezca la primera y la última posición Z en la ventana de escaneo en vivo. Presione detener y haga clic en Iniciar experimento para adquirir una imagen de pila Z.
      NOTA: Asegúrese de que se incluya un punto de normalización (el punto de convergencia del axón) al capturar imágenes para que sea posible la cuantificación de la regeneración (Figura 1D, 1F) - esto se discute más adelante en la sección de análisis de datos.
   5. Cambie a Procesamiento de imagen, seleccione la imagen que acaba de tomar y genere una proyección de intensidad máxima. Guarde las imágenes de proyección de pila z y de máxima intensidad.

Resultados

Figura 1: La regeneración de axones de la neurona Da en la periferia muestra la especificidad de clase. (A y B) Dibujo esquemático que muestra la posición de las larvas. (C) Dibujo esquemático de neuronas de clase III da. (D) Los axones de las neuronas da de clase III ddaF, marcados con 19-12-Gal4, UAS-CD4-tdGFP, repo-Gal80/+, no vuelven a crecer. (E) Di...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Éter dietílico, reactivo ACS, anhidro	Acros Organics	AC615080010
Aceite Halocarbon 27	Genesee Científico	59-133
Ácido propiónico	J.T.Baker	U33007
Cubreobjetos: Rectángulos	Fisher Científico	12-544-D	50 mm X 22 mm
Microscopio láser de barrido Zeiss LSM 880	Zeiss
Software Zen	Zeiss
Camaleón Ultra II	coherente