$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Este protocolo es un extracto de Catrina et al., Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers, J. Vis. Exp. (2019).
1. Diseño de MBs para Imágenes de Células Vivas
- Pliegue la secuencia de ARN objetivo para predecir la estructura secundaria del objetivo de ARNm utilizando la "forma de ARN" del servidor mfold (http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/RNA-Folding-Form).
- Pegue/cargue la secuencia de destino en formato FASTA, seleccione 5 o 10% de suboptimalidad (estructuras con una energía libre de plegado dentro del 5 o 10% del valor MFE, respectivamente) y ajuste el número máximo de plegamientos calculados en consecuencia (por ejemplo, mayor para un 10% de suboptimalidad).
NOTA: La inclusión de estructuras secundarias subóptimas al diseñar MB permite la identificación de regiones dentro del ARNm objetivo que pueden ser más flexibles o más rígidas de lo previsto para la estructura de energía libre mínima (MFE) solamente, lo que mejora el diseño general de MB adecuadas para la obtención de imágenes de células vivas.
- Seleccione un "trabajo inmediato" para objetivos de ARNm de 800 nucleótidos (nt), o un "trabajo por lotes" para longitudes de ARNm entre 801 y 8.000 nt. Guarde el archivo "ss-count" como un archivo de texto simple.
- Utilice el archivo "ss-count" obtenido en el paso 1.1 como entrada para el programa PinMol (https://bratulab.wordpress.com/software/) con los parámetros deseados, para diseñar varios MB para el objetivo de ARNm (consulte los tutoriales que describen el uso del programa PinMol en https://bratulab.wordpress.com/tutorial-pinmol-mac/ ).
- Determine la especificidad de los MB seleccionados mediante la realización del análisis BLAST: utilice "blastn" con la base de datos adecuada (por ejemplo, para los MB específicos de ARNm de oskar, utilice la base de datos "refseq-rna" y el organismo Drosophila melanogaster).
- Identifique cualquier expresión específica de tejido de la diana de ARNm (por ejemplo, para oskar mRNA Flybase> High-Throughput Expression Data> FlyAtlas Anatomy Microarray o modENCODE Anatomy RNA-Seq; http://flybase.org/reports/FBgn0003015) y comparar con cualquier golpe positivo de BLAST. Eliminar las sondas que muestran una homología cruzada del >50% con otros ARNm que también se expresan en el tejido/célula de interés.
- Seleccione el par de fluoróforo y extintor apropiado para la configuración de microscopía disponible para realizar imágenes de células vivas (por ejemplo, Cy5/BHQ2).
2. MB Síntesis, purificación y caracterización
- Utilice la síntesis y purificación internas, como se ha descrito anteriormente en Bratu, Methods in Molecular Biology (2006), o servicios de proveedores comerciales, para sintetizar y purificar de uno a cinco MB (véase la nota anterior), utilizando el siguiente esquema de etiquetado: [5' (fluoróforo)-(enlazador C3 o C6)-(secuencia de 2'-O-metil MB)-(Quencher)3']. Purifique los MB mediante HPLC de fase inversa, internamente o utilizando los servicios del proveedor comercial.
NOTA: Las fosforamiditas utilizadas para la síntesis automatizada de sondas deben tener la modificación de ribonucleótidos 2'-O-metilo. También se pueden utilizar quimeras de modificación alterna de ácido nucleico bloqueado (LNA) y 2'-O-metilo para aumentar la estabilidad de un híbrido entre un MB más corto y su ARNm objetivo.
- Sintetizar oligonucleótidos de ADN que coincidan con la secuencia de la región de ARN objetivo y, por lo tanto, sean complementarios a la región de sonda de los MB, para su uso en la caracterización in vitro (consulte los pasos 2.3 a 2.5; nota anterior). Maximizar la hibridación del MB con el imitador de diana de oligonucleótidos de ADN, incluyendo en cada extremo de la diana de ADN cuatro nucleótidos adicionales, tal y como se encuentran en la secuencia de ARNm diana.
NOTA: Se puede realizar una caracterización más rigurosa de la eficiencia del MB para detectar la secuencia dirigida utilizando objetivos de ARN sintetizados in vitro en lugar de oligonucleótidos de ADN complementarios.
- Realice la desnaturalización térmica del MB solo, mida su temperatura de fusión (Tm) y confirme que el MB asume la forma de horquilla deseada a temperatura fisiológica. Hemos observado valores de Tm entre 60 y 90 °C.
- Realizar la desnaturalización térmica del MB en presencia del oligonucleótido del ADN objetivo y medir la Tm del híbrido MB:ADN objetivo, como se describió anteriormente en Bratu, Methods in Molecular Biology (2006). Se desea una Tm entre 55 y 60 °C para el híbrido MB:DNA.
- Realizar reacciones de hibridación in vitro con el objetivo de oligonucleótidos de ADN correspondiente y determinar la eficiencia de la formación de híbridos MB:DNA a temperatura fisiológica, como se describió previamente en Bratu, Methods in Molecular Biology (2006). Se desea una cinética de hibridación rápida con el imitador de dianas de ADN, sin embargo, los MB que no muestran una alta eficiencia de hibridación con dianas de ADN pueden tener un mejor rendimiento con el ARNm diana in vitro y/o in vivo.
3. Disección y preparación de cámaras individuales de huevos para microinyección
- Alimente a las hembras recién nacidas y apareadas durante 2-3 días con pasta de levadura fresca.
- Anestesiar moscas en una almohadilla de CO2 y, usando pinzas finas (Dumont # 5), transfiera 1-2 hembras a una gota de aceite Halocarbon 700 en un engobe de cubierta de vidrio.
- Con un par de pinzas, oriente la mosca con el lado dorsal hacia arriba bajo un microscopio estereoscópico. Disecciona el abdomen femenino haciendo una pequeña incisión en el extremo posterior y exprime suavemente el par de ovarios en el aceite.
- Explanta los ovarios en una gota de aceite en un nuevo cubreobjetos. Sostenga suavemente un ovario con una pinza mientras pellizca las etapas más jóvenes del ovario con la otra pinza. El ARNm de oskar se localiza activamente a mediados y después de la ovogénesis (etapas > 7), y las cámaras de óvulos más jóvenes (etapas < 7) son más difíciles de inyectar y no sobreviven tanto tiempo. Arrastre lentamente el cubreobjetos (con un movimiento hacia abajo) hasta que los ovariolos individuales o las cámaras de huevos estén aislados y alineados verticalmente. Separe aún más las cámaras de huevos individuales desplazando las etapas no deseadas de la cadena de huevos ovariolos.
NOTA: Asegúrese de que las cámaras de huevos cardadas individualmente no floten en el aceite y que se adhieran al cubreobjetos. Esto es importante tanto para el éxito de la microinyección como para la adquisición de imágenes.
4. Microinyección de MBs en las células nodrizas de las cámaras de óvulos
- Prepare la solución de MB, utilizando una baliza molecular (por ejemplo, osk2216Cy5), o una combinación de dos MB que se dirijan a diferentes ARNm y que estén marcados con fluoróforos espectralmente distintos (por ejemplo, osk2216Cy5 y drongo1111Cy3). Utilice una concentración de 200-300 ng/μL cada MB en HybBuffer (50 mM de Tris-HCl - pH 7,5, 1,5 mM de MgCl2 y 100 mM de NaCl). Para un cóctel de cuatro MB marcados con el mismo fluoróforo que se dirigen al mismo ARNm a 200 ng/μL cada uno en HybBuffer (por ejemplo, osk82, osk1236, osk2216). Gire la solución MB inmediatamente antes de cargar la aguja para la microinyección.
- Seleccione el objetivo. Se recomienda un objetivo de aceite 40x para encontrar una cámara de huevos adecuada y para realizar la microinyección.
- Monte el cubreobjetos con la cámara de huevos disecados en la platina del microscopio. Coloque el objetivo en la posición de enfoque e identifique una cámara de óvulos en una etapa de desarrollo media a tardía, que esté correctamente orientada para la microinyección (es decir, con el eje AàP perpendicular a la punta de la aguja para permitir una inyección fácil dentro de una célula nodriza proximal al ovocito).
- Cargue una aguja (comercial o preparada internamente) con ~1 μL de solución MB (consulte el paso 1.1) y conéctela al microinyector. Para microinyecciones en cámaras de huevos de D. melanogaster, oriente la aguja (ver Tabla de materiales) en un ángulo <45° con respecto a la platina del microscopio (por ejemplo, 30°) para evitar perforar varias células nodrizas.
- Configure el inyector con una presión de inyección de 500-1.000 hPa y una presión de compensación de 100-250 hPa (consulte la tabla de materiales).
- Mueva lentamente el escenario para traer al campo de visión un área de la gota de aceite vacía de cámaras de huevos.
- Con el joystick del micromanipulador, baje suavemente la aguja en la gota de aceite y enfoque su punta hacia la periferia del campo de visión.
- Realice una función de "limpieza" para eliminar el aire de la punta de la aguja y asegurarse de que haya flujo de la aguja.
- Lleve la aguja a la posición inicial y concéntrese en la cámara del huevo que se va a microinyectar, luego vuelva a enfocar la aguja y colóquela cerca del borde de la cámara del huevo.
- Realice un ajuste fino de la posición Z del objetivo de modo que la membrana que separa las células del folículo de las células nodrizas esté enfocada.
- Inserte la aguja en una celda de enfermería y realice la inyección durante 2-5 s.
- Retire suavemente la aguja y retírela a la posición inicial.
- Cambie el objetivo a la ampliación deseada para la adquisición de imágenes (60-63x o 100x), concéntrese en la cámara de huevos y comience la adquisición.