$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Este protocolo es un extracto de Du et al., Una estrategia eficiente para generar sistemas de transcripción binarios específicos de tejido en Drosophila mediante la edición del genoma, J. Vis. Exp. (2018).
1. Genética y cribado de moscas (Figura 1 y Figura 2)
- Cuando los embriones inyectados se conviertan en adultos, cruce cada una de las moscas G0 con moscas balanceadoras. Seleccione el equilibrador adecuado para el cromosoma que contiene el alelo objetivo.
- Anestesiar a las crías F1 de cada cruza G0 en una almohadilla de CO2 y elegir aleatoriamente de 10 a 20 machos bajo un microscopio estereoscópico. Crúzalos individualmente a las hembras equilibradoras como se muestra en Figura 2.
- Cuando las larvas F2 eclosionen, elija el único padre F1 de cada cruza y extraiga el ADNg utilizando el protocolo de preparación de ADN genómico de mosca única:
- Prepare el tampón de extracción de ADNg: 10 mM de Tris-Cl pH 8,2, 1 mM de EDTA, 25 mM de NaCl, almacenar a temperatura ambiente. Prepare 20 mg/mL de solución madre de proteinasa K y guárdela en el congelador.
- Coloque cada mosca en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y etiquete el tubo. Conservar en el congelador a -80 °C durante la noche.
- Prepare un volumen de trabajo fresco de tampón de extracción de ADNg que contenga una concentración final de 200 μg/mL de proteinasa K.
Nota: No utilice un búfer antiguo para este paso.
- Aplaste cada mosca durante 10-15 s con una punta de pipeta que contenga 50 μL de tampón de aplastamiento sin dispensar el líquido. Dispense el tampón restante en el tubo y mezcle bien. Incubar a 37 °C durante 20-30 min.
- Coloque los tubos en un bloque térmico de 95 °C durante 1-2 minutos para inactivar la proteinasa K.
- Girar durante 5 min a 10.000 x g. Almacene la preparación a 4 °C para un análisis posterior por PCR.
- Utilice el mismo método para preparar el ADNg de una mosca nos-Cas9, que sirve como control negativo. Realice cribas basadas en PCR de tres pasos para identificar el HDR correcto de "terminación" (Figura 1, Figura 3) utilizando el ADNg de cada macho F1 como plantilla5. Utilice 1 μL de la preparación de ADN en el siguiente sistema de reacción de PCR: 10 μL de 2x PCR Master Mix con colorante, 1 μL de cada cebador (10 μM), 1 μL de plantilla de ADN y 7 μL de ddH2O.
- Como se muestra en Figura 3A, realice PCR usando los cebadores fwd1 y rev1 para detectar la existencia de la inserción o el reemplazo; realice la PCR usando cebadores fwd2 y rev2 para verificar la inserción o el reemplazo de la región 3'; realice la PCR usando los cebadores M13F y rev3 para verificar el HDR "final" (Tabla 1C).
- Mantenga las líneas de mosca con los extremos HDR confirmados y establezca existencias equilibradas de la generación F2. El cruzamiento al equilibrador vuela de nuevo para eliminar cualquier mutación no deseada en otros cromosomas.
