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Este protocolo es un extracto de Koon et al., Preparación de Organismos Procariotas y Eucariotas Utilizando el Secado Químico para el Análisis Morfológico en Microscopía Electrónica de Barrido (SEM), J. Vis. Exp.(2019).
1. Preparación y fijación
- Prepara Drosophila melanogaster (mosca de la fruta).
- Anestesia a las moscas adultas con 100% de dióxido de carbono. Coloque a los adultos anestesiados (alrededor de 10 a 30 moscas) en un pequeño frasco de plástico con tapa de rosca o en un tubo de centrífuga de 1.5 mL.
- Sumerja las moscas anestesiadas en 1 mL de fijador (1,25% de glutaraldehído, 0,1 M de tampón de fosfato pH 7,2) durante 2 h (o toda la noche) a 4 °C. Si las moscas flotan hacia la superficie del fijador, agregue unas gotas de éter de terc-octilfenilo de polietilenglicol al 2,5% para debilitar la tensión superficial del fijador, lo que permite la inmersión total del tejido. Retire el fijador con una pipeta de vidrio.
2. Lavado y deshidratación
- Lavar y deshidratar Drosophila melanogaster (mosca de la fruta).
- Lavar la muestra fija tres veces con 1 mL de tampón de fosfato 0,1 M pH 7,2 a temperatura ambiente durante 10 min en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Retire cada lavado con una pipeta de vidrio, teniendo cuidado de no eliminar las moscas.
- Deshidratar la muestra utilizando una serie de etanol graduado, durante 10 min en un volumen de 1 mL en un tubo de microfuga. Las concentraciones de etanol son: 25%, 50%, 75%, 80%, 95%, 100%. Retire el etanol con una pipeta de vidrio, teniendo cuidado de no eliminar las moscas.
- Conserve la muestra en el tubo de microcentrífuga de 1,5 ml con suficiente etanol al 100% para cubrir la muestra antes del secado.
3. Secado
- Realizar el secado químico con hexametildisilazano (HMDS).
- Reemplace la solución de etanol al 100% con una solución 1:2 de HMDS y etanol al 100% durante 20 min. Reemplace la solución 1:2 con una solución 2:1 de HMDS y etanol al 100% durante 20 min. Reemplace la solución 2:1 con HMDS al 100% durante 20 min. Repita una vez.
Nota: El HMDS es inflamable y una toxina aguda (vía dérmica). El HMDS debe manipularse en una campana de gases químicos utilizando el equipo de protección personal adecuado, incluidos guantes, bata de laboratorio y protección para los ojos.
- Transfiera la muestra en HMDS, si está en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, a un plato de pesaje de aluminio desechable. Una vez en el plato de pesaje de aluminio, reemplace el 100% HMDS con el 100% HMDS fresco suficiente para cubrir la muestra.
- Transfiera la muestra a un desecador de plástico o vidrio sin vacío con desecante fresco (5-6 cm de profundidad) y colóquela en una campana de gases químicos. Alternativamente, coloque la muestra directamente en una campana de extracción de gases químicos para que se seque con una tapa suelta, como una caja, para evitar que caigan residuos sobre la muestra. Deje que la muestra se seque durante 12 a 24 h.
4. Montaje
- Monte Drosophila melanogaster (mosca de la fruta).
- Etiquete la parte inferior del trozo de montaje de aluminio para indicar lo que se está colocando en la parte superior.
Coloque las moscas secas en la posición deseada sobre una lengüeta adhesiva o adhesiva de carbón asegurada a la parte superior de un trozo bajo un microscopio de disección con pinzas de precisión.
- Aplique adhesivo conductor de plata, es decir, pintura plateada, alrededor de los bordes exteriores de los talones. Conecte la pintura plateada a las moscas con un palillo de dientes para garantizar la conductividad. No permita que la pintura toque el área de imagen deseada.
- Coloque los talones en una caja de soporte de talones y coloque la caja de soporte de talones abierta en un desecador. Deja que la pintura plateada se seque al menos 3 horas o toda la noche para obtener mejores resultados.