Este protocolo es un extracto de Sunderhaus y Kretzschmar, Histología de masas para cuantificar la neurodegeneración en Drosophila, J. Vis. Exp. (2016).
1. Fijación de la cabeza en collares e incrustación en parafina
NOTA: Todos los pasos del proceso de fijación deben realizarse en una campana extractora. El metilbenzoato, aunque no representa un riesgo para la salud, tiene un olor muy distintivo, que puede ser abrumador si no se maneja en una campana extractora.
- Antes de anestesiar las moscas, prepare 50 mL de solución de Carnoy agregando 15 mL de cloroformo y 5 mL de ácido acético glacial a 30 mL de etanol al 99% (no mezcle el cloroformo y el ácido acético). Viértalo en un recipiente de vidrio con un fondo plano, como un plato de cristalización, para asegurarse de que los collares puedan quedar planos y estén completamente cubiertos por la solución.
- Anestesia a las moscas conCO2 o éter.
- El hilo vuela (hasta 20 con la mayoría de los collares) por el cuello hacia los collares con pinzas. Recuerde alinear todas las cabezas en la misma orientación, como se ve en Figure 1A, y sea suave para asegurarse de que no se produzcan daños en la cabeza o los ojos.
- Incluya moscas sine oculis (flechas, Figura 1A) en posiciones aleatorias para que el orden de las moscas pueda identificarse fácilmente en las secciones. Además, si las moscas experimentales tienen un color de ojos claro o blanco, enhebra algunas moscas de ojos rojos, como las de tipo salvaje, entre ellas para asegurarse de que haya suficiente pigmento para manchar el portaobjetos. Registre el orden de las moscas en una hoja de protocolo junto con el número de collar si usa más de un collar.
- Una vez que se haya terminado un collar, colóquelo en la solución de Carnoy preparada durante 3,5 - 4 h.
- Vierta la solución de Carnoy en el recipiente de eliminación apropiado y comience los lavados con etanol. Asegúrese de verter lentamente para no perturbar la ubicación de los collares en el recipiente.
- Lave los collares durante 30 minutos en etanol al 99% dos veces.
- Lave los cuellos en etanol 100% durante 1 h. Asegúrese de cambiar los lavados a tiempo para evitar la deshidratación excesiva.
- Coloque los collares en metilbenzoato O/N en RT. Selle el recipiente con parafilm para evitar la evaporación del metilbenzoato.
- Vierta el metilbenozato en el recipiente desechable adecuado en la campana extractora. Añadir una mezcla previamente preparada de cera de parafina 1:1 de bajo punto de fusión (56 - 57 °C) y metilbenzoato. A partir de este momento, los collares deben mantenerse en una incubadora a 65 °C para asegurarse de que la parafina no se endurezca.
- Vierta la mezcla de metilbenozato y parafina en el recipiente desechable adecuado y vierta cera de parafina pura fundida, mantenida a 65 °C, sobre los collares.
- Cambie la parafina después de 30 minutos y repita esto al menos 5 veces. Se deben realizar al menos 6 a 8 lavados.
- Una vez que se completen los lavados, coloque los collares en una bandeja de cubitos de hielo de goma con ranuras aproximadamente del tamaño de los collares. Vierta parafina fundida sobre ellos hasta que estén completamente cubiertos y deje que se endurezca O/N (trate de evitar las burbujas de aire).
- Retire los bloques de parafina que contienen los collares de la bandeja de cubitos de hielo. Separe el bloque de parafina del collar con una cuchilla de afeitar, rompiendo suavemente el collar. Las cabezas estarán en el bloque de parafina mientras que los cuerpos permanecerán en el collar. Los bloques se pueden mantener a temperatura ambiente.
- Para limpiar los collares, sumérjalos en un agente de desparafinización a 65 °C para eliminar la parafina, limpie con un fregado ligero y lave en etanol antes de volver a utilizar.
