Este protocolo es un extracto de Nazario-Toole y Wu, Evaluación de la respuesta inmune celular de la mosca de la fruta, Drosophila melanogaster, utilizando un ensayo de fagocitosis in vivo, J. Vis. Exp. (2019).
1. Preparar las partículas de fluoresceína para la inyección
- Reconstituya 10 mg de partículas de bacterias muertas por calor disponibles comercialmente marcadas con fluoresceína (consulte la Tabla de materiales) a una concentración de stock de 10 mg/mL agregando 990 μL de PBS estéril 1x y 10 μL de azida sódica 50 mM. Vórtice para mezclar.
- Divida en alícuotas de 8 μL de un solo uso en tubos de 0,2 mL y guárdelas en una caja oscura a 4 °C para minimizar la sensibilidad asociada a la luz><.
NOTA: El conservante de azida sódica es opcional y puede omitirse si se elaboran existencias de 10 mg/mL con 1 mL de PBS estéril 1x, alícuotas, y se almacenan a -20 °C.
- Haga una solución de 10 ml de colorante alimentario al 5% en 1x PBS mezclando 500 μL de colorante alimentario verde filtrado con jeringa y 1x PBS estéril de 9,5 mL.
- Lave las partículas antes de la inyección para eliminar la azida de sodio. Mezclar 42 μL de PBS estéril 1x y 8 μL de 10 mg/mL en un tubo de 1,7 mL. Centrifugar a velocidad máxima durante 2,5 min a temperatura ambiente.
- Retire el sobrenadante, agregue 50 μL 1x PBS y centrifugue a velocidad máxima durante 2,5 min a temperatura ambiente.
- Repita los pasos 1.3 y 1.3.1 2 veces, para un total de 3 lavados.
- Después del lavado final, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las partículas a 1,6 mg/mL en 50 μL de colorante alimentario al 5% en 1x PBS.
- Envuelva el tubo en papel de aluminio para protegerlo de la luz. Conservar a 4 °C, desechar después de 1 semana.
2. Prepare la estación de inyección y moscas
- Prepare la almohadilla de inyección. Para inyectar hasta 4 genotipos de moscas al mismo tiempo, use cinta de laboratorio para dividir una almohadilla rectangular deCO2 en 4 secciones. En el banco cerca del microscopio, designe áreas para colocar los viales una vez que las moscas se hayan alineado en la almohadilla (una para cada esquina de la almohadilla).
- Prepare viales de moscas de 4 a 7 días de edad para inyectar. Para cada cepa que se vaya a analizar, transfiera 5 machos y 5 hembras a un frasco fresco y etiquetado de alimento preparado para moscas y manténgalo a 25 °C.
- Prepare el inyector neumático (consulte la Tabla de materiales) ajustando el instrumento a un modo TEMPORIZADO de 100 ms (ráfagas cortas de presión de gas para expulsar el líquido, lo que permite la entrega de volúmenes sub-nanolitros).
- Prepara los portaobjetos del microscopio. Corta tiras de cinta aislante de 1,5 pulgadas, dóblalas en un bucle con el lado adhesivo hacia afuera y colócalas en un portaobjetos de microscopio etiquetado.
3. Preparar agujas capilares de vidrio
- Tire de las agujas de vidrio (capilares de vidrio de pared delgada) con un extractor de agujas.
- Sostenga la aguja bajo el microscopio con un micrómetro y rompa la punta con unas pinzas de acero inoxidable de punta fina # 5. Las puntas de 100 μm son suficientes para perforar la cutícula de la mosca y minimizar las heridas.
- Mide el volumen de líquido que se inyectará en cada mosca. Cargue la aguja con colorante alimentario estéril al 5% en 1x PBS y expulse el líquido sobre una gota de aceite mineral en un micrómetro de platina de 0,01 mm.
NOTA: Si la gota de líquido es esférica, el volumen en picolitros se calcula como (tamaño)3/1910. Una aguja con un diámetro de 100 μm expulsará ~2 nL en 100 ms.
4. Inyectar moscas
- Pipetear 10 μL de partículas de 1,6 mg/mL en un pequeño cuadrado de parafilm.
- Introduzca el líquido en la aguja y móntelo en la boquilla del inyector (consulte la tabla de materiales).
- Anesthetize las moscas con CO2 y alinélas en su área designada en la almohadilla de mosca, con el lado ventral hacia arriba y las cabezas orientadas hacia la parte delantera de la almohadilla. Coloque los viales en las áreas correspondientes del banco.
- Inyecte moscas en la esquina superior del abdomen con 5 bombas de líquido de 100 ms (~10 nL en total).
- Transfiera las moscas inyectadas a los viales apropiados, anote la hora en el vial. Mantener a 25 °C.
- Cargue una aguja nueva con una solución de azul de tripano al 0,4%.
- Ajuste el inyector neumático a GATED, lo que permite un flujo constante de aire para empujar el líquido fuera de la aguja.
- Anestesiar a las moscas después de que hayan descansado durante 30 min e inyectar con Azul de Trypan hasta que el abdomen esté lleno y distendido.
NOTA: Al examinar la maduración de los fagosomas con partículas marcadas con un tinte sensible al pH, deje que las moscas descansen durante 1 h y no inyecte azul de tripano antes de montar las moscas.
- Monte las moscas en portaobjetos de microscopio con cinta aislante, con la parte ventral hacia abajo. Empuja las alas hacia el lado de la mosca y asegúralas a la cinta. Además, empuje suavemente la cabeza dentro de la cinta para asegurarse de que la mosca no se mueva.
