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Este protocolo es un extracto de Bantel y Tessier, Taste Preference Assay for Adult Drosophila, J. Vis. Exp. (2016).
1. Hambruna
- Prepare los viales para la inanición de moscas empapando una bola de algodón con 18,2 MΩ de agua en el fondo de un vial estándar para moscas. Alternativamente, sature de manera similar una pequeña tira de papel de filtro con 18,2 MΩ de agua y colóquela en ángulo dentro del vial.
- Recoja las moscas en grupos de ~ 100 animales en una almohadilla de CO2 y luego agregue las moscas a un vial preparado.
NOTA: Los mejores resultados se obtienen con animales de menos de 5 días de edad. Sin embargo, la edad exacta de los animales puede controlarse como variable experimental para determinar los cambios en la preferencia gustativa a lo largo del tiempo.
- Use una bola de algodón o un tapón de espuma para asegurar los viales cerrados. Coloque los viales de lado en una incubadora controlada ambientalmente. Mantenga la temperatura a 25 °C y la humedad por encima del 70%. Deje los viales sin tocar durante 24 horas.
2. Ensayo de preferencia de sabor
- Prepare todos los catantes para el ensayo el mismo día de la prueba.
NOTA: Los sabores exactos que se utilizarán variarán dependiendo de la pregunta experimental que se haga. A continuación se muestran ejemplos de tasantes utilizados en este protocolo. Consulte la sección 4 para ver las optimizaciones.
- Prepare el sabor de control (1 mM de sacarosa) combinando 10 μl de solución de sacarosa 100 mM, 13 μl de colorante alimentario rojo y 977 μl de 18,2 MΩ de agua.
- Prepare un sabor experimental (5 mM de sacarosa) combinando 50 μl de solución de sacarosa de 100 mM, 10 μl de colorante alimentario azul y 940 μl de 18,2 MΩ de agua.
- Realice cámaras de ensayo utilizando una placa de Petri de plástico estándar de 100 mm x 15 mm preparada de la siguiente manera:
- Coloque tres gotas de 10 μl de sabor de control más cerca del borde del plato a las 12 en punto y otras 3 gotas a las 6 en punto. Asegúrese de que el espaciado entre las gotas sea similar.
- Coloque tres gotas de 10 μl de sabor experimental más cerca del borde del plato a las 3 en punto y otras 3 gotas a las 9 en punto. Asegúrese de que el espaciado entre las gotas sea similar.
- Repita los pasos 2.2.1 y 2.2.2 para tantas réplicas como desee.
- Vacíe 1 vial de ~ 100 moscas hambrientas en una almohadilla de CO2 el tiempo suficiente para anestesiar a todos los animales (aproximadamente 10 segundos). Cepille los animales en el centro de una cámara de ensayo preparada y cúbralos con la tapa del plato.
NOTA: Deben evitarse los períodos prolongados de exposición al CO2 para mejorar el tiempo de recuperación y limitar la interferencia con el comportamiento alimentario. La exposición al hielo (~ 5 min) se puede usar como anestesia para evitar los efectos conductuales del CO2 que pueden surgir incluso de una exposición limitada.
- Coloque la cámara de ensayo en una caja de cartón opaca. Asegúrese de etiquetar el exterior de la caja con la afección y el genotipo que se está analizando.
- Coloque toda la instalación (la cámara de ensayo contenida dentro de la caja de cartón del paso 2.4) en una incubadora a 25 °C con al menos un 70% de humedad durante 2 horas.
- Repita los pasos 2.3 a 2.5 para todas las réplicas.
- Después de 2 horas, coloque las cámaras de ensayo, aún contenidas dentro de cajas de cartón, directamente en un congelador a -20 °C hasta que estén listas para la cuantificación.
3. Cuantificación del ensayo de preferencia de sabor
- Deje que una sola cámara de ensayo se caliente a temperatura ambiente (aproximadamente 5 min).
- Bajo un microscopio de disección, usando un cepillo o un par de pinzas, agrupe a los animales según el color de su abdomen: rojo, azul, púrpura o transparente (Figura 1).
- Registre el número de animales en cada agrupación. Considere que los animales claros no han participado en el ensayo y, por lo tanto, no los incluya en ningún cálculo.
- Calcule el índice de preferencia de acuerdo con una de las siguientes ecuaciones:
- Si al tinte rojo se le añade el sabor experimental de interés, utilice (Nrojo + 0,5Nmorado)/(Nrojo + Nazul + Nmorado).
- Si se agrega el sabor experimental al tinte azul, ajuste la ecuación a (Nazul + 0.5Npúrpura)/(Nazul + Nrojo + Npúrpura).
- Repita los cálculos para todas las condiciones experimentales y réplicas.
4. Optimización del ensayo de preferencia de sabor
- Determine empíricamente la concentración de indicadores de colorante alimentario que se utilizará para que el colorante alimentario no afecte el resultado del ensayo de sabor, de la siguiente manera:
- Prepare 4 degustantes utilizando el mismo compuesto base (por ejemplo, 5 mM de sacarosa) como se indica en el paso 2.1, pero omita el colorante alimentario.
- Añade un 1,3% de colorante alimentario rojo a uno de los degustantes. Haga los 3 sabores restantes con colorante alimentario azul de diferentes concentraciones en cada tubo (por ejemplo, 0,6%, 1% y 1,3%).
- Complete los pasos del protocolo 2.2 a 3.4 para cada par de sabores: 1,3% rojo vs. 0,6% azul; 1,3% rojo vs. 1% azul y 1,3% rojo vs. 1,3% azul.
- Repita los pasos 4.1.1-4.1.3 con diferentes porcentajes de colorante alimentario azul hasta que el índice de preferencia promedie un valor de 0 (Figura 2).
NOTA: Como punto de partida, un 1,3% de colorante alimentario rojo junto con un 1% de colorante alimentario azul suele dar buenos resultados. Si no se puede igualar una concentración satisfactoria de colorante alimentario azul con un colorante al 1,3%, se pueden repetir los pasos 4.1.1 a 4.1.3 con concentraciones variables de colorante rojo y una concentración constante de colorante alimentario azul.
- Analice todas las condiciones que se van a probar con las mismas concentraciones optimizadas de colorante alimentario.
