Este protocolo es un extracto de Diegelmann et al., The CApillary FEeder Assay Food Intake in Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2017).
1. Montaje y realización del ensayo FEeder CApillar
- Si no es necesario el ayuno, transfiera las moscas experimentales al ensayo mediante golpecitos o sopletes. Asegúrese de incluir tres viales de control sin moscas para cuantificar la evaporación.
- Retire con cuidado la punta de una pipeta (volumen de 2 a 20 μL) que está cerrando una de las aberturas exteriores e inserte un capilar de vidrio lleno, con el extremo inferior primero. Asegure el capilar colocando la punta de la pipeta de nuevo junto al capilar. Si se están probando varias soluciones alimentarias, repita este procedimiento en consecuencia.
- Coloque los extremos capilares dentro de todos los viales al mismo nivel para evitar sesgos que podrían ocurrir si las fuentes de alimento estuvieran ubicadas a diferentes alturas (3 - 4 cm de la tapa); mantenga una distancia con el papel de filtro para evitar que el capilar se filtre al tocar accidentalmente el papel de filtro o las diferentes viscosidades de las fuentes de alimento.
- Etiquete el extremo superior del líquido coloreado con un rotulador (marqueel comienzo). Para asegurarse de que se puedan identificar los diferentes capilares, etiquételos individualmente con un código de color o raya.
- Coloque varios ensayos CAFE preparados dentro de una caja de plástico con incrustaciones cuadriculadas y transfiera la caja (Figura 2A) a una posición segura en condiciones de laboratorio o en una cámara climática con control de temperatura, luz y humedad (parámetros: 25 °C, 60% de humedad relativa, ciclo de luz-oscuridad de 12 h/12 h) durante el período experimental (por ejemplo, 3 h o días).
- Dado que el papel de filtro inferior se seca si el ensayo se realiza durante varios días, aplique agua dulce cada 24 horas a través del tapón de esponja (100 μL) para mantener la humedad constante dentro del ensayo. Utilice cuatro viales separados (8 cm de altura, 3,3 cm de diámetro) llenos de 30 mL ddH2O como dispositivos de humedad y colóquelos junto a los ensayos CAFE en la caja de plástico. Utilice una cubierta para la caja de plástico para crear un ambiente de humedad controlada durante el experimento (Figura 2A).
NOTA: La variabilidad más amplia ocurre en condiciones de laboratorio; sin embargo, es factible realizar el ensayo CAFE a temperatura ambiente (por ejemplo, en un salón de clases). Se recomienda encarecidamente el uso de un dispositivo de humidificación (papel de filtro, con o sin tapón de esponja húmedo, viales de agua llenos y tapa para la caja de plástico) para disminuir la evaporación (Figura 2B).
- Reemplace los capilares por otros recién llenos para experimentos a largo plazo cada 24 h. Anote las moscas muertas antes de cada intervalo de 24 h y use el número de moscas vivas para calcular el consumo por mosca para el siguiente período. Deseche los capilares viejos después de medir el declive del menisco (ver 2.1).
NOTA: Durante un experimento de 3 h apenas vemos moscas muertas. Durante un estudio de 4 días solemos encontrar de 1 a 3 moscas muertas.
- Al final del ensayo o antes de reemplazar el capilar, marque el menisco inferior del capilar (extremo de la marca) con un rotulador mientras el ensayo CAFE aún está en posición vertical. Descarte los datos si elfinal de la marca no está por debajo de la marca inicial (inicio de la marca). No retire la tapa, ya que esto podría cambiar el menisco.
- Retire con cuidado los capilares del ensayo y guárdelos para la recopilación de datos. Verifique si el líquido dentro del capilar llegó al extremo inferior si no desecha los datos, ya que el alimento no estaba accesible para las moscas. Recoja todos los capilares por vial como un grupo. Inserte las puntas de pipeta sin cortar en todas las aberturas para evitar que las moscas se escapen. Desmonte la instalación y lave los viales, las tapas y los tapones de esponja en un baño de jabón y séquelos durante la noche a temperatura ambiente para su uso posterior.
NOTA: Las moscas se pueden analizar más a fondo después del ensayo. Confirme la ingesta de alimentos a ojo o bajo un microscopio de disección.
- Repita los experimentos con los mismos genotipos en al menos tres días diferentes.
2. Recopilación y análisis de datos
- Mida la distancia entre elinicio y elfinal de la marca en el capilar con un calibrador o una regla. Para transferir datos directamente a una hoja de cálculo, utilice un calibrador digital conectado por USB (Universal Serial Bus) (Figura 1E). Deseche los capilares después de la medición.
- Tenga en cuenta el tamaño capilar para calcular la absorción o evaporación de alimentos. Por ejemplo, considere un capilar de 73 mm de largo y contiene 5 μL de solución alimentaria. Una disminución de 14,6 mm en el menisco refleja la absorción de 1 μL de solución. Calcule la ingesta de alimentos utilizando la siguiente fórmula:
Ingesta de alimentos (μL) = distancia medida (mm)/ 14,6 mm
- Para excluir el efecto de la evaporación en la ingesta de alimentos, calcule la evaporación media en los tres viales de control (como mínimo) sin moscas. Reste este valor medio del valor obtenido por las moscas para el consumo de alimento.
- Utilice la siguiente fórmula para determinar el consumo total por mosca:
Consumo de alimentos (μL) = (Consumo de alimentos [μL] - Pérdida por evaporación [μL])/número total de moscas en el vial. Para experimentos a largo plazo, utilice el número de moscas vivas antes del inicio del intervalo de 24 horas.
- Para tener en cuenta las diferencias en el tamaño corporal, por ejemplo, entre moscas macho y hembra, normalice el consumo de alimentos al peso corporal (μL de comida/mg de mosca).
- Utilice software estadístico para el análisis de datos. Para datos distribuidos normalmente, use las pruebas T de Student para determinar las diferencias entre dos grupos de moscas, y use ANOVA (análisis de varianza) con pruebas post hoc de Tukey Cramer para más de dos grupos. En una situación de elección, analice las diferencias de la elección aleatoria utilizando una prueba de signo no paramétrica de una muestra.
