Este protocolo es un extracto de Tenenbaum y Gavis, Eliminación de tejido muscular de Drosophila de filetes de larvas para el análisis de inmunofluorescencia de neuronas sensoriales y células epidérmicas, J. Vis. Exp.(2016).
NOTA: El procedimiento para la eliminación de músculo (Figura 1) es una modificación de los métodos descritos anteriormente para preparar filetes de larvas. Los pasos que preceden y siguen a la extracción muscular se describen brevemente y se remite al lector a trabajos previos en Brent, et al., J. Vis. Exp. (2009) y Karim y Moore, J. Vis. Exp. (2011) para descripciones más detalladas.
1. Diseccionar larva en solución salina fría
- Prepare una dilución de trabajo de solución salina HL3.1 fría o solución salina HL3.1 fría sin Ca2+ (Tabla 1). Coloque la larva en un plato de elastómero de silicona con suficiente solución salina fría para cubrir el fondo del plato.
NOTA: Recomendamos experimentar con el uso de solución salina HL3.1 libre de Ca2+ en comparación con la solución salina estándar HL3.1 durante la disección de larvas. En ausencia de calcio, las contracciones musculares de las larvas se reducen considerablemente. Por lo tanto, los filetes de larva pueden ser más fáciles de manipular cuando se diseccionan en solución salina HL3.1 libre de Ca2+. Sin embargo, encontramos que la contracción muscular crea espacio entre el músculo y la epidermis y esto puede facilitar la inserción de pinzas entre estos tejidos al tiempo que minimiza el riesgo de daño a la epidermis. Como resultado, el estándar HL3.1 puede ser preferible para preservar la integridad de la epidermis y las neuronas da. Obtenemos buenos resultados con cualquiera de las dos soluciones salinas y la elección queda en manos del usuario.
- Coloque la larva con el lado ventral hacia arriba. La superficie ventral de la larva se puede identificar por los cinturones dentarios abdominales y la cara dorsal por los tubos traqueales primarios de la larva que van de anterior a posterior. Estire la larva en la dirección antero-posterior y sujete la cabeza y la cola a un plato de disección de elastómero de silicona con alfileres para insectos. Use tijeras finas de disección para cortar a lo largo de la línea media ventral, comenzando en un extremo y progresando hacia el otro.
NOTA: Esta orientación preserva el grupo dorsal de neuronas da comúnmente estudiado.
- Después de cortar la larva, sujeta las cuatro esquinas al plato de disección como si abrieras un libro. Use fórceps para agarrar y extraer los órganos internos, incluidos el SNC, el intestino y la tráquea. Ajuste los alfileres de insectos para que el filete esté tenso pero no estirado al máximo.
NOTA: Los músculos están anclados a la pared del cuerpo en los límites segmentarios. Aunque los músculos cubren la mayor parte de la pared del cuerpo, están ausentes en una región estrecha cerca de la línea media dorsal.
2. Eliminación de músculo
- Localiza la línea media dorsal de la larva, donde el tejido muscular está ausente. Coloque una sola punta de pinza de manera que pueda insertarse debajo del tejido muscular en la orientación más plana posible.
- Comenzando en la línea media dorsal, cerca del límite anterior del segmento, deslice con cuidado la punta de la pinza entre el músculo y la epidermis, teniendo cuidado de minimizar el contacto entre la pinza y la epidermis.
- Tire de las pinzas hacia arriba para romper la unión del músculo a la pared del cuerpo en un punto de anclaje. Repita este proceso para el (los) hemi-segmento (s) restante (s) de interés.
NOTA: Este protocolo optimiza la preservación de la parte posterior de cada campo de dendritas de neuronas da. Para preservar la parte anterior del campo de dendritas, lo mejor es insertar la punta de la pinza en el extremo posterior de cada segmento.
- Vuelva a ajustar los alfileres de insectos de modo que el filete de larva se estire al máximo en todas las direcciones.
- Fije el filete mientras aún está clavado en el plato de disección con formaldehído al 4% frío y recién preparado en PBS durante 25 minutos.
- Enjuague 5 veces en PBS.
- Use fórceps para separar con cuidado el tejido muscular de los puntos de anclaje restantes, teniendo cuidado de minimizar el contacto con la epidermis.
- Desenganche y retire el filete de la placa de disección a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Realice todos los pasos posteriores de lavado, bloqueo y tinción de inmunofluorescencia, como se describió anteriormente en Karim y Moore, J. Vis. Exp. (2011).
