Este protocolo es un extracto de Reimels y Pfleger, Métodos para examinar la glándula linfática y los hemocitos en larvas de Drosophila, J. Vis. Exp. (2016).
1. Inmunohistoquímica de la glándula linfática larvaria
NOTA: La glándula linfática se encuentra aproximadamente a un tercio de la longitud del extremo anterior de una larva, ligeramente por debajo del cerebro en el lado dorsal. (Vea la flecha en Figura 1B.) La glándula linfática flanquea el vaso dorsal y se disecciona más fácilmente adherida a los ganchos bucales o al cerebro. Los ganglios linfáticos de tercer estadio de tipo salvaje son estructuras muy pequeñas; Los lóbulos primarios miden aproximadamente 100 - 200 μm de longitud. (Ver Figura 2A.)
- Para obtener larvas de aproximadamente la misma etapa de desarrollo para este ensayo, restrinja la recolección de huevos permitiendo que las hembras pongan huevos durante un período de tiempo fijo de 2 a 6 horas.
- Disección de glándulas linfáticas
- Para cada condición experimental, agregue 1 ml 1x PBS (Tabla 1) a un pocillo de una placa de 24 pocillos.
- Agregue 1 gota de PBST al 0.1% (Tabla 1) a cada pocillo usando una pipeta de transferencia desechable.
NOTA: Se agrega detergente, como Tween 20, para reducir la tensión superficial, lo que permite que el tejido se hunda hasta el fondo del pozo.
- Coloque el plato plano sobre hielo.
- Recoja las larvas en pozos de disección llenos de 1x PBS.
- Coloque una almohadilla de disección limpia sobre una base de microscopio estereoscópico iluminada. Utilice una pipeta de transferencia desechable para colocar pequeñas gotas de PBST al 0,01 % (Tabla 1) en la almohadilla. Transfiera una larva a una gota de PBST para su disección.
- Sostenga la larva con un par de pinzas aproximadamente a un cuarto de distancia del extremo posterior, con el lado dorsal hacia arriba.
- Use otro par de pinzas para agarrar la cutícula inmediatamente anterior a las pinzas que sostienen la larva. Tire suavemente de la cutícula hacia el extremo anterior hasta que los ganchos bucales queden expuestos.
NOTA: El objetivo es pelar la cutícula sin alterar ninguna estructura interna.
- Suelta la cutícula y usa ambas pinzas para cortar la larva en dos. Retire el extremo posterior de la gota PBST.
NOTA: Si la cutícula no se pela hasta los ganchos bucales, corte la larva en dos y retire el extremo posterior. Use un par de pinzas para sostener el borde de la cutícula y use el otro par de pinzas para empujar los ganchos bucales a través de la abertura. Esto invertirá la cutícula y expondrá los ganchos bucales. Esto también se puede utilizar como un método de disección alternativo.
- Use un par de pinzas para sujetar la cutícula (ya sea la cutícula ventral, el colgajo de la cutícula dorsal o ambos) para mayor estabilidad.
- Use otro par de pinzas para agarrar los ganchos bucales expuestos y sáquelos suavemente.
NOTA: Esto separará la cutícula de las estructuras internas. Idealmente, los discos imaginales oculares/antenas, el cerebro, la glándula anular y la glándula linfática que flanquean el vaso dorsal permanecerán unidos a los ganchos bucales.
- Mientras aún sostiene los ganchos bucales, retire con cuidado las estructuras no deseadas, como las glándulas salivales, el cuerpo graso y el intestino><.
NOTA: Si el cerebro se separa de los ganchos bucales, es posible que la glándula linfática aún esté unida al cerebro y se recoja con él. En este caso, sostenga el cordón nervioso ventral en lugar de los ganchos bucales.
- Usando los ganchos bucales o el cordón nervioso ventral como mango, transfiera el complejo disecado que contiene la glándula linfática al pocillo en hielo. No exceda los 30 minutos antes de la fijación.
- Fijación e inmunohistoquímica
- Coloque la placa de 24 pocillos en la base del microscopio estereoscópico.
- Utilice una pipeta p200 para retirar con cuidado el PBST del pocillo.
NOTA: Los pozos vacíos y vecinos son útiles para depositar temporalmente los residuos.
- Agregue suavemente 200 μl de formaldehído al 3,7% (Tabla 1) por el costado del pocillo y agite la placa para asegurarse de que los tejidos disecados estén completamente sumergidos.
- Vuelva a poner el plato en hielo durante 30 min. Si los ganglios linfáticos expresan proteínas fluorescentes, mantenga la placa cubierta para evitar el fotoblanqueo.
- Utilice una pipeta p200 para retirar con cuidado el fijador.
- Lavar añadiendo 200 μl 1x PBS al pocillo y colocando la placa en un agitador orbital durante 5 min a temperatura ambiente. Utilice una pipeta p200 para extraer con cuidado el PBS.
NOTA: Las glándulas linfáticas fijas se pueden dejar en hielo en PBS hasta que se disecen y fijen las glándulas linfáticas para todas las afecciones experimentales.
- Repite los pasos de lavado dos veces más.
- Agregue 200 μl de solución de permeabilización (Tabla 1) al pocillo. Coloque la placa en un agitador orbital durante 45 minutos a RT.
NOTA: 45 min es el "estándar de oro" para la permeabilización de las glándulas linfáticas, pero los autores tienen éxito después de solo 20 min.
- Retire la solución con una pipeta p200.
- Diluya el anticuerpo primario con la solución de anticuerpos (Tabla 1) de acuerdo con las especificaciones del proveedor. Agregue 300 μl de solución de anticuerpos primarios al pocillo y asegúrese de que los tejidos disecados estén completamente sumergidos. Incubar a 4 °C durante la noche.
- Utilice una pipeta p200 para extraer el anticuerpo primario.
- Lavar añadiendo 200 μl 1x PBS al pocillo y colocando la placa en un agitador orbital durante 10 min a temperatura ambiente. Utilice una pipeta p200 para retirar con cuidado el PBS.
- Repite los pasos de lavado dos veces más.
- Diluya el anticuerpo secundario con la solución de anticuerpos de acuerdo con las especificaciones del proveedor. Agregue 300 μl de solución de anticuerpos secundarios al pocillo y asegúrese de que los tejidos disecados estén completamente sumergidos. Incubar en un agitador orbital durante al menos 2 horas a RT.
- Utilice una pipeta p200 para eliminar el anticuerpo secundario y lávese como se describe en los pasos 1.3.12 y 1.3.13. No retire el PBS después del lavado final.
- Montaje de glándulas linfáticas
- Limpie los portaobjetos de vidrio del microscopio con etanol al 70% (Tabla 1) y toallitas de tejido.
- Para cada condición experimental, coloque una gota de tampón de montaje (Tabla 1) en el portaobjetos de vidrio.
NOTA: Dos condiciones caben en una diapositiva. El volumen del tampón de montaje depende del número de glándulas linfáticas que se van a montar. Use 2 μl para aproximadamente 18 a 20 glándulas linfáticas, 1 μl para 10 a 12 y 0.5 μl para 5 o menos.
- Coloque el portaobjetos del microscopio sobre una base de microscopio estereoscópico iluminada.
- Para hasta dos afecciones a la vez, transfiera todas las glándulas linfáticas del pocillo al tampón de montaje con pinzas, utilizando los ganchos bucales o el cordón nervioso ventral como mango.
- Separe los tejidos diseccionados de manera uniforme en forma circular o rectangular, extendiendo el tampón de montaje en el proceso.
- Para cada uno de los tejidos disecados, individualmente, deslice una pinza de las pinzas por debajo del vaso dorsal y tire suavemente hacia la periferia del tampón de montaje><.
NOTA: Esto extraerá la glándula linfática del resto de los tejidos disecados y aplanará la glándula linfática en el vidrio.
- Con una pinza de las pinzas y un movimiento de sierra, corte el vaso dorsal entre la glándula linfática y el cerebro.
- Mueva el resto de los tejidos disecados al lado opuesto de la glándula linfática, en el borde más externo del tamp><ón.
NOTA: Los tejidos disecados no deseados eventualmente formarán un perímetro alrededor de las glándulas linfáticas y servirán como un soporte sobre el cual descansará el cubreobjetos.
- Repita hasta que todas las glándulas linfáticas estén separadas de los tejidos disecados, reservando uno de los tejidos disecados no deseados para colocarlo en el centro.
- Toma un cubreobjetos entre dos dedos. Compruebe que el cubreobjetos esté libre de polvo y huellas dactilares. Si es necesario, use una toallita de papel y etanol al 70% para limpiar el cubreobjetos.
- Asegurándose de que el borde del cubreobjetos esté paralelo al borde del portaobjetos de vidrio, baje con cuidado el cubreobjetos sobre el tope de montaje.
NOTA: Los portaobjetos del microscopio pueden almacenarse a 4 °C antes de la obtención de imágenes. El tiempo máximo de almacenamiento depende de la estabilidad de los anticuerpos utilizados. Las placas de 24 pocillos se pueden enjuagar y reutilizar.
2. Imágenes
- Tome imágenes de hemocitos fijos y glándulos linfáticos montados en un microscopio confocal o de fluorescencia estándar apropiado con un aumento de 20X o más de acuerdo con el manual de instrucciones del fabricante. Visualice larvas enteras en un microscopio estereoscópico estándar con un aumento de 2X de acuerdo con el manual de instrucciones del fabricante.
- Siga las instrucciones del proveedor de software para la deconvolución, si lo desea.
