Este protocolo es un extracto de Kelly et al., Disección y tinción inmunofluorescente de neuronas fotorreceptoras y cuerpo de hongo en cerebros adultos de Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2017).
1. Preparación de la estación de disección
- Coloque el microscopio estereoscópico y la fuente de luz con cuellos de cisne de fibra óptica adjuntos en una mesa de trabajo grande. Para promover movimientos constantes de la mano y reducir el "temblor" de la mano durante la disección, es esencial que haya suficiente espacio para las manos y los brazos alrededor del microscopio. Asegúrese de que haya aproximadamente de 8 a 10 pulgadas a cada lado del microscopio y de 4 a 6 pulgadas entre la base del microscopio y el borde del banco.
- Llene 2 o 3 pocillos de un plato de vidrio de 9 o 3 pocillos con 1,0 mL de tampón PTN (0,1 M de tampón de fosfato de sodio pH 7,2, surfactante no iónico al 0,1%, consulte la Tabla de materiales para ver los componentes completos del tampón) y colóquelo junto a la estación de disección en hielo. Los cerebros recién diseccionados se transferirán a este plato y se almacenarán hasta la etapa de fijación.
NOTA: Si se requieren imágenes en vivo, el tampón de disección debe ser 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS) o tampón HL3. Si se requiere la localización intracelular de proteínas, el PBS también se puede utilizar como tampón alternativo para la disección y la fijación. Después de la fijación, la permeabilización de las membranas celulares debe realizarse utilizando lavados de PTN que contengan detergente no iónico al 0,1% o al 0,3%.
- Si se utiliza PBS para disecciones y fijación, las puntas de pipeta deben enjuagarse al menos una vez con un tampón que contenga detergente (como PTN) para evitar que los cerebros se peguen a las puntas de pipeta de plástico durante la transferencia a los tubos de microcentrífuga.
- Usando una placa de Petri vacía de vidrio o plástico de 35 mm, construya una placa de disección que contenga un elastómero de silicona. Brevemente, mezcle los componentes del elastómero de acuerdo con las instrucciones del fabricante, viértalos en platos de 35 mm y déjelos polimerizar durante la noche sobre una superficie plana. Se deben usar placas de disección que contengan elastómeros para proteger las puntas finas de las pinzas de disección, que pueden dañarse fácilmente si se hace contacto entre las pinzas y una superficie más dura, como una placa de vidrio. También compramos regularmente platos recubiertos de silicona disponibles en el mercado de minoristas en línea. Para aumentar el contraste durante las disecciones, las placas de disección de elastómero de silicona que contienen carbón inactivado (y, por lo tanto, de color negro) son particularmente útiles.
2. Procedimiento de disección del cerebro en adultos
- Anestesiar a un adulto de 3 a 5 días de edad con D. melanogaster con CO2 o mediante el uso de hielo. Si usa hielo, coloque el frasco que contiene moscas boca abajo (con el tapón hacia abajo) en una cubeta de hielo durante ~ 5 min. Colocar el vial en hielo boca abajo evita que las moscas se alojen en la comida. Una vez que las moscas hayan sido anestesiadas, colóquelas en una almohadilla de metal fría o en una placa de Petri colocada en hielo o en una almohadilla que emitaCO2. Si se diseccionan cerebros para analizar la neurodegeneración, también se pueden usar moscas más viejas.
- Coloque una pequeña cantidad (150 - 200 μL) de PTN en el centro de la placa de disección utilizando una pipeta de transferencia o una pipeta p200 para crear una "burbuja" de PTN. Coloque la placa de disección bajo el microscopio estereoscópico y ajuste la iluminación y el enfoque para que la burbuja de PTN llene el campo de visión y se ilumine uniformemente.
- Manipule las moscas para que estén "boca arriba" (es decir, con el lado ventral hacia arriba) mientras están acostadas sobre la almohadilla de metal o CO2.
- Con un par de pinzas #5, agarre el abdomen de una mosca que se va a diseccionar y, manteniendo la mosca sujeta, sumérjala completamente en el PTN en el plato de disección><.
NOTA: Para el resto del protocolo, todos los pasos deben realizarse mientras la cabeza está sumergida en PTN.
- Usando un segundo par de pinzas #5, agarre la base de la probóscide de mosca y separe los dos pares de pinzas para separar la cabeza de la mosca del cuerpo. Deseche el abdomen y el tórax. Durante este paso, es fundamental que la cabeza no se suelte y se permita flotar en la superficie de la PTN. Una vez que la cabeza está flotando, puede ser muy difícil volver a agarrarla sin aplastar el cerebro.
NOTA: Con este método, se cortan las conexiones entre el cerebro y el cordón nervioso ventral. Si se requieren conexiones intactas entre estas regiones del SNC, se debe seguir un protocolo de disección alternativo. Si la probóscide se separa de la cabeza de la mosca antes de que se retire la cabeza, habrá un agujero donde estaba la probóscide. En este caso, agarre la cabeza de la mosca en el borde del agujero cerca de un ojo. A continuación, retire la cabeza con una fuerza moderada mientras separa los dos pares de pinzas entre sí. En ocasiones, cuando se retira la cabeza del cuerpo, el intestino y/o el cordón nervioso ventral permanecen unidos a la cabeza y deben retirarse antes de continuar con la disección.
- Mientras un par de pinzas agarra la probóscide, el segundo par debe agarrar el borde medial del ojo derecho de la mosca. Lentamente, separe las pinzas entre sí. Este paso debe realizarse con una pequeña cantidad de fuerza lateral constante. A medida que las pinzas se separan lentamente unas de otras, la probóscide debe separarse de la cabeza y crear un orificio central en la cutícula de la cabeza. Deseche la probóscide con el primer par de pinzas sin soltar la porción medial del ojo derecho del segundo par.
NOTA: El cerebro adulto de D. melanogaster se encuentra en la región caudal (es decir, posterior/posterior) de la cabeza de la mosca. Por lo tanto, se debe evitar agarrar esa región de la cabeza. Idealmente, solo la parte rostral (es decir, frontal) de la cabeza cerca de la retina medial debe ser agarrada directamente por las pinzas. El cerebro y la tráquea asociada ahora deberían ser visibles a través del orificio central de la cutícula. En este momento, se pueden quitar y desechar los hilos blancos y fibrosos de la tráquea que sobresalgan del orificio.
- Con el segundo par de pinzas, agarre el borde medial de la retina izquierda (en el borde del orificio central de la cutícula de la cabeza). Para extirpar las retinas y la cutícula asociada, separe lentamente las pinzas entre sí en un ángulo de 180°. A medida que la retina se disocia del lóbulo óptico subyacente, debería sentir una ligera disminución de la tensión. Proceda lentamente para evitar desgarrar el lóbulo óptico.
NOTA: Separar las pinzas demasiado rápido durante este paso puede provocar el desgarro del lóbulo óptico o la alteración de las estructuras corporales de los hongos. En ocasiones, se extirpará la cutícula, pero partes de la retina permanecerán unidas al lóbulo óptico. Si se obtienen imágenes de los cuerpos de los hongos, no es completamente necesario extirpar toda la retina. Sin embargo, el análisis de otras regiones del cerebro (como la inervación de las neuronas retinianas de los lóbulos ópticos del cerebro) puede requerir que la retina se extirpe por completo, como se describe en
NOTA: A medida que la retina se separa lentamente del lóbulo óptico subyacente del cerebro, el lóbulo óptico debe ser observable como una estructura blanca opaca cubierta de tráquea blanca y fibrosa. Una vez que se ha extirpado una retina, se puede desechar. Al analizar la búsqueda de rutas de las neuronas de la retina, se debe tener especial cuidado durante este paso para evitar daños en el lóbulo óptico. También está disponible un protocolo adicional centrado en la disección y la obtención de imágenes en vivo de las neuronas fotorreceptoras.
- Ahora, retire con cuidado la mayor cantidad posible de la tráquea visible. Es posible que la tráquea ya contenga o se llene más tarde de aire, lo que hace que los cerebros floten y, potencialmente, se pierdan durante los pasos posteriores de inmunotinción. Para extirpar la tráquea, quítala del cerebro con un par de pinzas #5 muy afiladas.
- Extirpe la retina restante y la cutícula circundante utilizando ambos pares de pinzas para agarrar la región medial de la retina de la mosca izquierda. Desgarre cuidadosamente la retina por la mitad para extraer partes de la retina y la cutícula. En algunos casos, la extirpación de la cutícula restante sin aplastar el cerebro resulta especialmente difícil. En estos casos, hemos encontrado que las hebras restantes del cordón nervioso ventral pueden ser agarradas por un par de pinzas, mientras que el otro par de pinzas se usa para quitar cuidadosamente la última parte de la cutícula.
- Con una pipeta p200, mueva los cerebros disecados a un pocillo de la placa de 9 o 3 pocillos que contiene PTN. Los cerebros del mismo genotipo deben agruparse en el mismo pozo y mantenerse en hielo. El tejido cerebral debe fijarse dentro de una hora después de la disección. Los cerebros pueden fijarse en pequeños lotes y agruparse si se requiere un mayor número de cerebros. En la mayoría de las circunstancias, un investigador experimentado generalmente puede diseccionar un cerebro y transferirlo al plato de recolección de vidrio en aproximadamente 3 a 5 minutos.
