$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Este protocolo es un extracto de Koyle et al., Criando la mosca de la fruta Drosophila melanogaster bajo condiciones axénicas y gnotobióticas, J. Vis. Exp. (2016).
1. Huevos decorionados y transferencia a dieta estéril
- Prepare la cabina de bioseguridad rociando el interior (incluidos los lados) con etanol al 70%. Limpie la parte inferior con un pañuelo de laboratorio y esterilice la capucha con luz ultravioleta durante ~ 15 minutos. Esterilice todos los suministros no biológicos (recipientes de muestras, pincel, pinzas, contenedor de desechos, 400 ml de agua esterilizada y 100 ml de hipoclorito de sodio al 0,6%) rociándolos con etanol y colocándolos inmediatamente en la cabina de bioseguridad. Esterilizar con luz ultravioleta durante 15 min.
- Comience el primero de los 2 lavados con hipoclorito de sodio colocando el casquillo con los huevos en un vaso de muestra de 120 ml u otro recipiente estéril. Vierta lentamente ~ 90 ml de solución de hipoclorito de sodio al 0,6% en el casquillo hasta justo debajo del borde.
- Enjuague los huevos durante 2.5 min. Vuelva a suspender periódicamente los huevos usando pinzas para mover el casquillo hacia arriba y hacia abajo en la solución de hipoclorito.
- Transfiera el casquillo directamente a un segundo recipiente de muestras, precargado con lejía de 90 ml, dentro de la cabina de bioseguridad.
- Repita el paso 1.3 dentro de la cabina de bioseguridad. Al final del segundo tratamiento de blanqueo, los huevos deben comenzar a adherirse a los lados del casquillo.
- Lleve a cabo los pasos 1.7-1.8 en el gabinete de bioseguridad.
- Deseche la lejía y lave el casquillo con agua estéril 3 veces. Vuelva a suspender los huevos varias veces durante cada lavado moviendo el casquillo con pinzas. Al final del tercer lavado, la mayoría de los huevos deben estar adheridos al costado del casquillo.
- Usando un pincel esterilizado en etanol, transfiera los huevos del costado del casquillo a la dieta estéril. Transfiera los huevos individualmente o en lotes pequeños. Trate de consumir de 30 a 50 huevos por vial. Deje las tapas sueltas para permitir que el oxígeno ingrese al tubo. Si los viales van a permanecer axénicos, transfiéralos a una incubadora de insectos; De lo contrario, agregue las bacterias como se muestra a continuación.
2. Hacer moscas gnotobióticas usando 4 especies bacterianas
- Preparar las bacterias
- Prepare una cabina de bioseguridad esterilizada con los suministros necesarios (pipetas, cajas de puntas de pipeta, tubos de centrífuga esterilizados, caldo MRS y gradillas de tubos de ensayo) como en el paso 1.1. Limpie el exterior de los tubos de ensayo con una toallita de laboratorio empapada en etanol antes de colocarlos en el gabinete de bioseguridad.
- Granule las bacterias transfiriendo primero 500 μl de crecimiento nocturno a un tubo de microfuga estéril. Si la densidad bacteriana es baja, agregue hasta 1,5 ml a cada tubo o elimine secuencialmente el sobrenadante y agregue cultivo adicional al mismo tubo. Retire las muestras de la cabina de bioseguridad y centrifuga durante 10 minutos a 10.000 x g. Utilice las puntas de los filtros para evitar la contaminación entre las muestras.
- Determine la densidad de cada cultivo midiendo OD600. Si utiliza un lector de placas de pocillos múltiples, transfiera 200 μl de cada cultivo a una placa de 96 pocillos en diluciones de 1, 2 y 4 veces.
- Determine la cantidad de mMRS en la que se debe diluir cada gránulo de celda (2.1.2) utilizando un espectrofotómetro de lectura de placas y las siguientes ecuaciones. Planee agregar suficiente caldo para inocular 50 μl a cada vial de mosca.
- Recoja lecturas de OD600 para una dilución 1:1, 1:2 y 1:4 de cada cultivo bacteriano en un espectrofotómetro de lectura de placas. Seleccione la dilución para cada cepa bacteriana que produzca un valor de OD600 comprendido entre 0,1 y 0,2 y utilice este valor y su factor de dilución correspondiente como 'O' y 'D' en las fórmulas dadas en 2.1.4.2 o 2.1.4.3.
- Si se utilizan las 4 especies descritas aquí, normalice las células a densidades equivalentes de unidades formadoras de colonias (UFC)/ml (conversión de OD600 a UFC determinada previamente en Newell y Douglas, Appl Environ Microbiol. (2014)) utilizando esta ecuación:
E = ((O-B) x V x D)/C
donde E = volumen para resuspender el pellet en (μl), O = OD600 bacterias, B = OD600 medios en blanco, D = plegado-dilución, V = μl de cultivo bacteriano antes de la centrifugación, C = OD600 de constante predeterminada. Consulte el archivo de código complementario para ver ejemplos de cálculos con estas ecuaciones. Para espectrofotómetros que se silencian automáticamente, use "O" en lugar de "O-B".
NOTA: Las constantes predeterminadas (unidades OD600, normalizadas a 107 UFC ml-1, constantes derivadas en Newell y Douglas, Appl Environ Microbiol. (2014)) son los siguientes: A. tropicalis (0,052), A. pomorum (0,038), L. brevis (0,056), L. plantarum (0,077).
- Si se utilizan otras especies bacterianas (no se dispone de una constante CFU/OD600), normalice la densidad a OD600 = 0,1 utilizando esta ecuación:
E = ((O-B) x V x D)/0,1 OD600
NOTA: Las unidades son las mismas que en el paso 2.1.4.2. Consulte el archivo de código complementario para ver ejemplos de cálculos con estas ecuaciones.
- En la cabina de bioseguridad, retire el sobrenadante con una punta de pipeta y vuelva a suspender el pellet en mMRS o PBS fresco como se calcula en el paso 2.1.4.2.
- Inocular bacterias
- Transfiera 50 μl de las bacterias a los tubos cónicos con dieta estéril y huevos descorionados en cabina de bioseguridad. Agregue bacterias después de la transferencia de huevos para evitar la contaminación entre viales.
- Coloque los tubos inoculados en una incubadora a 25 °C.
3. Medir la carga de UFC/Probar la esterilidad
- Para medir la carga de UFC en homogeneizados de moscas de cuerpo entero, transfiera 5 moscas (5-7 días después de la eclosión) a un tubo de microfuga de 1,7 ml que contenga 125 μl de perlas de cerámica y 125 μl de caldo mMRS. Homogeneizar moscas utilizando un homogeneizador de tejidos durante 30 segundos a 4,0 M/seg.
- Alternativamente, omita las perlas y homogeneice a mano en tubos de microcentrífuga con morteros de plástico durante 1 minuto.
- Si se trata de cuantificar la microbiota intestinal, hay que esterilizar las moscas en la superficie para eliminar los microbios exógenos. Transfiera las moscas a un tubo de microcentrífuga que contenga 100 μl de etanol al 70% durante 1 min, aspire el etanol y transfiéralo a un nuevo tubo de microcentrífuga para homogeneizaciones. Si se va a medir el contenido de ADN del intestino, enjuague durante 1 minuto con hipoclorito de sodio al 0,6% antes del lavado con etanol.
- Diluya el homogeneizado con 875 μl de mMRS, vórtice durante 5 segundos y pipetee 120 μl de homogeneizado en el primer pocillo de una placa de microtitulación.
- Realice dos diluciones secuenciales 1:8 utilizando 10 μl de homogeneizado y 70 μl de MRS en los dos pocillos siguientes.
- Extraiga 10 μl del primer pocillo y añádalo al segundo pocillo que contenga 70 μl de MRS. Mezcle bien el contenido del segundo pocillo, transfiera 10 μl del segundo pocillo al tercer pocillo que contenga 70 μl de MRS y mezcle bien. Esto da lugar a 3 concentraciones totales del homogeneizado original de 1.000 μl: sin diluir, 1:8 y 1:64.
- Transfiera 10 μl de cada dilución a una placa mMRS (utilizando una pipeta multicanal si lo desea). Incline ligeramente el plato para esparcir la dilución varios milímetros por la superficie del agar y deje que el líquido se seque antes de mover el plato. El líquido se seca rápidamente en la placa si las placas tienen 2 días de antigüedad, lo que reduce la mezcla de dos gotas vecinas.
- Incubar a 30 °C durante 1-2 días. Retire las placas de la incubadora una vez que se distingan, las colonias individuales sean visibles y cuente desde una dilución con 10-100 colonias aisladas.
- Calcule UFC por mosca utilizando la ecuación E = C x D/P x V/F, donde E = UFC por mosca, C = número de colonias contadas, D = dilución, P = μl plateado, V = volumen de mosca homogeneizada y F = número de moscas homogeneizadas.