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Este protocolo es un extracto de Guan et al., Visualice los axones de la neurona motora de la pierna de Drosophila a través de la cutícula adulta, J. Vis. Exp.(2018).
1. Disección y fijación de la pierna
- Tome una placa de vidrio de varios pocillos y llene el número adecuado de pocillos con etanol al 70%. Agregue de 15 a 20 moscas anestesiadas con CO2 (de cualquier sexo y cualquier edad) a cada pocillo y, con un cepillo, frote suavemente las moscas en la solución de etanol hasta que las moscas estén completamente sumergidas><.
NOTA: Este paso consiste en eliminar la hidrofobicidad de la cutícula. No lavar durante más de 1 minuto, ya que esto aumenta la autofluorescencia de la cutícula.
- Enjuague las moscas 3 veces con una solución de detergente tensioactivo no iónico al 0,3% en solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x. Mantenga las moscas en esta solución durante al menos 10 min.
NOTA: Las patas se fijan mejor cuando se incluye detergente, lo que probablemente aumente la penetración del fijador dentro de la pierna.
- Coloque una placa de pocillos múltiples sobre el hielo junto con un tubo de paraformaldehído (PFA) al 4%.
NOTA: La preparación de PFA fresco al 4% a partir de una solución madre sin etanol al 16% PFA es fundamental.
- Utilice fórceps para extraer la cabeza y el abdomen de las moscas sin dañar el segmento torácico ni las patas.
NOTA: La extirpación del abdomen facilita la sujeción de la mosca y la disección de las patas.
- Diseccione las patas del segmento torácico con pinzas y coloque las patas en los pocillos que contengan 4% de PFA. Para ello, empuje suave pero firmemente la unión coxa-tórax con la punta de unas pinzas finas hasta que la pierna se separe.
- Fije las patas en PFA al 4% durante la noche a 4 °C (aproximadamente 20 h en total).
- Lave las piernas con una solución de detergente tensioactivo no iónico al 0,3% en 1x PBS, 5x durante 20 minutos cada uno.
- Reemplace el tampón de lavado con medio de montaje. Mantenga la pata en el medio de montaje durante al menos un día antes del montaje para permitir su penetración completa en la pata.
NOTA: Si el medio de montaje es muy viscoso, diluya el medio de montaje al 80% con 1x PBS porque el cambio repentino de viscosidad puede hacer que la cutícula colapse y dañe la estructura general de la pierna. Dependiendo del controlador Gal4, las moscas se pueden conservar durante 1 a 3 semanas a 4 °C en el medio de montaje hasta el montaje.
2. Montaje de patas
Coloque aproximadamente 20 μL de glicerol al 70% en el lado izquierdo de un portaobjetos de microscopio y cúbralo con un cubreobjetos cuadrado de 22 x 22 mm 2 (Figura 1 A,B).- Pipetee unos 10 μL de medio de montaje a lo largo de una línea paralela y a una pequeña distancia del borde derecho de este cubreobjetos. Añada otros 30 μL de medio de montaje más adelante en el lado derecho de la corredera (Figura 1C).
NOTA: Al aplicar un cubreobjetos sobre las patas (ver más abajo), el medio de montaje se extenderá suavemente debajo del cubrecubreobjetos y alrededor de las patas sin desplazarlas.
- Con pinzas finas, levante la pierna de la solución y colóquela suavemente en el medio de montaje cerca del cubreobjetos izquierdo. Haga lo mismo para cada pata y alinéelas de arriba a abajo (Figura 1D).
- Levante y transfiera las piernas en una gota de medio sostenida entre ambas puntas de las pinzas. Orienta las piernas de dos maneras: con el lado externo hacia arriba o hacia abajo.
- Una vez que todas las patas (se pueden montar hasta 6-8 patas) estén correctamente alineadas, coloque un segundo cubrecubreobjetos sobre las patas de modo que este cubreobjetos descanse ligeramente sobre el cubreobjetos colocado anteriormente Figura 1E para dejar espacio entre el cubreobjetos y el tejido y evitar que las patas se dañen (Figura 1G).
NOTA: Alternativamente, use cubrebocas o cera de ortodoncia para crear espacio entre el cubreobjetos y el portaobjetos.
- Utilice un esmalte de uñas para asegurar la posición de los cubreobjetos en cada esquina (Figura 1F).
NOTA: El tejido ya está listo para la obtención de imágenes.
