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Este protocolo está extraído de Radford y McKim, Técnicas para la obtención de imágenes de la prometafase y la metafase de la meiosis I en ovocitos fijos de Drosophila, J. Vis. Exp. (2016).
NOTA: Los procedimientos se realizan a temperatura ambiente a menos que se indique lo contrario. Las incubadoras de temperatura controlada se utilizan para mantener las temperaturas para la cría de moscas y los cruces, a menos que se indique lo contrario.
1. Preparativos
- Prepara moscas.
- Colecciones de ovocitos enriquecidos con prometafase.
- Limpie las moscas adultas de ganado joven y sano o de cultivos cruzados. Envejecer las botellas durante dos días a 25 °C.
NOTA: Por lo general, dos biberones saludables serán suficientes, aunque es posible que se necesiten más para algunas culturas cruzadas.
- Después de dos días, recoja ~ 100 a 300 hembras (que tienen de 0 a 2 días de edad en este punto) de las botellas. Las hembras no necesitan ser vírgenes. Agregue un poco de pasta de levadura al costado de un vial y coloque 30 hembras y 10 a 15 machos cada uno en los viales con levadura. Envejecer los viales durante dos días a 25 °C.
- Colecciones de ovocitos enriquecidas con metafase.
- Recoja ~ 100 a 300 hembras de stock o cultivos cruzados. Agregue un poco de pasta de levadura al costado de un vial y coloque 30 hembras cada una (sin agregar machos) en los viales con levadura. Envejeza los viales durante tres a cinco días a 25 °C.
- Prepare Solutions.
NOTA: Las soluciones pueden almacenarse indefinidamente a temperatura ambiente, a menos que se indique lo contrario.
- Prepare el tampón de Robb modificado (5x): 500 mM de HEPES, 500 mM de sacarosa, 275 mM de acetato de sodio, 200 mM de acetato de potasio, 50 mM de glucosa, 6 mM de cloruro de magnesio y 5 mM de cloruro de calcio. Utilice hidróxido de sodio 10 N 11:8: hidróxido de potasio para llevar el pH a 7,4. Esterilizar por filtración; No lo haga en autoclave. Almacenar a -20 °C. Descongelar según sea necesario para preparar ~200 ml de 1x Robb's por preparación de ovocitos.
- Soluciones de fijación.
- Opción #1: Prepare la fijación de formaldehído/heptano. Prepare el tampón de fijación: 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS) más 150 mM de sacarosa. Para usar, refrescar con 687,5 μl de tampón de fijación y 312,5 μl de formaldehído al 16% por ovocitos prep.
cautela: Use guantes mientras usa soluciones de formaldehído en una campana extractora. Disponer de los residuos de acuerdo con los lineamientos institucionales.
- Opción # 2: Prepare la fijación de formaldehído / cacodilato. Prepare Fix Mix: 250 mM de sacarosa, 100 mM de acetato de potasio (pH 7.5), 25 mM de acetato de sodio (pH 7.0) y 25 mM de EGTA (pH 8.0). Para usar, refrescar con 400 μl de Fix Mix, 100 μl de cacodilato de potasio (1 M, pH 7,2) y 500 μl de formaldehído al 16% por ovocitos prep.
cautela: El cacodilato de potasio contiene arsénico.
- Preparación PBS/Triton X-100: 1x PBS más 1% o 0,05% Triton X-100. Conservar a 4 °C.
- Prepare PBS-Tween 20-Albúmina sérica bovina (BSA) (PTB): 1x PBS, 0.5% BSA (p/v) y 0.1% Tween-20. Puede almacenarse a 4 °C durante una semana.
2. Colección de ovocitos de Drosophila en etapa tardía
- Dado que los ovocitos de Drosophila con las membranas intactas se adhieren al plástico y al vidrio, recubra previamente el interior de un tubo de 5 ml y una pipeta Pasteur por preparación de ovocitos con PTB.
- Anestesiar todas las ~ 100 a 300 moscas con levadura con dióxido de carbono y agregar a una licuadora que contenga ~ 100 ml 1x Robb's Buffer. Pulse tres veces (~ 1 seg cada una). Mantenga los ovocitos en Robb's durante <20 min para evitar la activación.
NOTA: Alternativamente, los ovocitos pueden ser diseccionados a mano de las hembras. La ventaja de este método es que requiere menos hembras. Sin embargo, se debe tener cuidado de limitar la exposición al dióxido de carbono a solo unos pocos minutos para evitar artefactos asociados con la hipoxia.
- Filtre a través de una malla grande (~1.500 μm) en un vaso de precipitados de 250 ml para eliminar partes grandes del cuerpo. Si quedan muchos abdómenes intactos en la malla, vuelva a moler el material con Robb's Buffer adicional y vuelva a filtrar. Deje reposar ~ 2 minutos, luego aspire la capa superior, eliminando tantas partes grandes del cuerpo como sea posible.
- Filtrar a través de una malla pequeña (~300 μm) en un vaso de precipitados de 250 ml. Enjuague los ovocitos restantes del primer vaso de precipitados con pipeta Robb's y Pasteur recubierta adicional. Deje reposar ~ 3 min; Los ovocitos se asentarán. Aspire todo menos ~ 10 ml.
- Vierta la cantidad de 10 ml que quepa en el tubo recubierto de 5 ml. Deje reposar, retire el líquido y repita con el resto. Enjuague los ovocitos restantes del vaso de precipitados con una pipeta Robb's y Pasteur recubierta adicional. Deje reposar en un tubo de 5 ml durante ~ 3-5 min.
3. Tratamientos farmacológicos (opcional)
- Cubra un segundo tubo de 5 ml con PTB para cada preparación de ovocitos y añada el disolvente (control) o fármaco adecuado a 1 ml de Robb's cada uno para cada preparación de ovocitos (Tabla 1).
- Divida los ovocitos en un segundo tubo recubierto de 5 ml. Deje reposar, retire el líquido y agregue 1 ml de solvente Robb's plus en un tubo y 1 ml de medicamento Robb's plus en el segundo tubo. Nutato durante el tiempo adecuado para el tratamiento farmacológico (Tabla 1). Deja que se asiente.
4. Fijación
- Aspire todo el líquido y agregue inmediatamente 1 ml de Fix.
- Opción #1: Fijación de formaldehído/heptano (tampón de fijación más 5% de formaldehído).
- Fije durante 2,5 minutos en un nutator. Añadir 1 ml de heptano y vórtice 1 min. Deje reposar ~ 1 min.
- Retire todo el líquido y luego agregue 1 ml 1x PBS. Vórtice 30 seg. Deje reposar ~ 1 min.
- Retire todo el líquido y luego llene el tubo con 1x PBS.
NOTA: Los ovocitos pueden usarse inmediatamente o mantenerse en el nutator durante varias horas a temperatura ambiente.
- Opción #2: Fijación de formaldehído/cacodilato (Fix Mix más 8% de formaldehído y 100 mM de cacodylate).
- Arreglar durante 6 minutos en un nutator. Dejar reposar 2 min. Retire el líquido y luego llene el tubo con 1x PBS.
NOTA: Los ovocitos pueden usarse inmediatamente o mantenerse en el nutator durante varias horas a temperatura ambiente.
5. Eliminación de membranas ("rodadura")
- Usando una pipeta Pasteur recubierta, agregue ~ 500 a 1,000 ovocitos a la parte esmerilada (arenada) de un portaobjetos de vidrio. Retire todas las partes del cuerpo y el material extraño con pinzas. No deje que los ovocitos se sequen; agregue 1x PBS según sea necesario.
- Coloque un cubreobjetos encima de los ovocitos y "enrolle" suavemente los ovocitos hasta que se retiren todas las membranas (lo mejor es arrastrar el borde del cubreobjetos por los ovocitos). Verifique periódicamente el progreso bajo el microscopio, agregando más 1x PBS según sea necesario. Ten cuidado, ya que demasiada presión destruirá los ovocitos.